Este protocolo descreve a geração de quimeras misto murino da medula óssea com espontâneas centros germinativos auto-imune, na qual auto-reativas linfócitos transportar um repórter de proteína verde fluorescente (GFP-PA) photoactivatable. Isto fornece a capacidade de ligar a localização celular em tecidos com análises moleculares e funcionais a jusante.
Doenças auto-imunes apresentam um peso significativo para a saúde. Questões fundamentais sobre o desenvolvimento e a progressão da doença auto-imune permanecem sem resposta. Um requisito para os avanços em nossa compreensão dos mecanismos subjacentes da doença e dinâmica celular é o acoplamento preciso da localização microanatomical de subconjuntos de célula com a jusante análises moleculares ou funcionais; uma meta que tem sido tradicionalmente difícil de alcançar. O desenvolvimento de photoactivatable estável fluorophores biológica e a sua integração em cepas de repórter permitiu recentemente rotulagem microanatomical precisos e rastreamento de celulares subconjuntos em modelos murino. Aqui, descrevemos como a capacidade de analisar auto-reativas linfócitos de centros germinativos único pode ajudar a fornecer novos insights sobre auto-imunidade, usando a combinação de um novo modelo quimérico de auto-imunidade com um repórter de photoactivatable como um exemplo . Vamos demonstrar que um procedimento para gerar misturado quimeras com espontânea auto-reativas centros germinativos povoados por linfócitos carregando um repórter de proteína verde fluorescente photoactivatable. Usando estratégias de rotulagem in vivo, único centros germinativos podem ser visualizados em tecidos linfoides explantados e seus constituintes celulares fotoativados por microscopia de dois fotões. Fotoativados linfócitos de centros germinativos único podem ser analisados ou classificados cytometrically de fluxo, como células únicas ou a granel e podem ser submetidos a análises adicionais de moleculares e funcionais a jusante. Esta abordagem pode diretamente ser aplicada para fornecer insights renovadas no campo de auto-imunidade, mas o procedimento para a geração de quimeras de medula óssea e o procedimento de fotoativação adicionalmente encontrar ampla aplicação nos estudos de doenças infecciosas e metástases de tumor.
A incidência de doença auto-imune tem aumentado rapidamente nas últimas décadas, particularmente nas sociedades ocidentais. Hoje, fileiras de doença auto-imune em terceiro lugar na lista das causas mais prevalentes de morbidade e mortalidade no mundo ocidental1. Questões fundamentais sobre o desenvolvimento e a progressão da doença auto-imune permanecem sem resposta. Um requisito para os avanços em nossa compreensão dos mecanismos subjacentes da doença e dinâmica celular é o acoplamento preciso da localização microanatomical de subconjuntos de célula com a jusante análises moleculares ou funcionais. Na última década, o desenvolvimento de um número de estável fluorophores biológica photoconvertible, photoactivatable ou photoswitchable e a sua integração em cepas de repórter permitiu a rotulagem microanatomical precisos e rastreamento de celular subconjuntos em modelos murino.
Kaede, uma proteína fluorescente photoconvertible proveniente de um coral de stony, sofre photoconversion irreversível de fluorescência verde para fluorescência vermelha após a exposição à luz ultravioleta ou violeta2. Inicialmente contratado para seguir o comportamento dinâmico das células individuais no desenvolvimento de fatias de cérebro de organotypic3, geração de um Kaede bater-no rato posteriormente permitiu monitorar a movimentação celular in vivo e o sistema foi aplicada a análises de migração de células imunes para e de linfonodos4. Esta abordagem foi posteriormente refinada com um repórter da segunda geração5. Um repórter semelhante é Dendra6, que recentemente foi usado para rastrear metástases linfonodal em vivo7.
A primeira proteína de photoactivatable desenvolvida foi uma proteína verde fluorescente (GFP) projetada com uma única mutação pontual (T203H), levando a uma absorção muito baixa na região de comprimento de onda de 450 a 550 nm8. Após a fotoativação por luz violeta, esta proteína fluorescente verde photoactivatable (PA-GFP) liga seu máximo de absorção de 400 ~-~ 500 nm, rendendo uma intensidade aproximada de 100 vezes aumenta quando animado com um comprimento de onda de 488 nm. A geração de ratos transgênicos, em que todas as células hematopoiéticas expressam PA-GFP permitiu, pela primeira vez, análises aprofundadas de seleção de células B em zonas claras e escuras anatomicamente definidas do centro germinativo9.
Considerando que o photoactivation é uma conversão irreversível de um estado não-fluorescente para um estado fluorescente e photoconversion é uma transição unidirecional de um comprimento de onda para outra, photoswitchable proteínas são capazes de vaivém entre as duas condições10 . Este último capacidade recentemente foi aproveitada para engenheiro de controle óptico de proteína atividade11.
Estamos utilizando o repórter PA-GFP, recentemente caracterizado os repertórios de células B de centros germinativos único em um novo modelo de auto-imunidade espontânea do lúpus, como12. Este modelo é baseado em quimeras misturadas com 1 parte de medula abrigando um auto-reativas células B receptor bater em com especificidade para complexos de ribonuclear-proteína (564Igi,13,14) combinado com 2 partes da medula de qualquer desejado dador. Em aproximadamente 6 semanas pós reconstituição condições homeostáticas são alcançadas na qual auto-reativas espontânea centros germinativos estão presentes no baço e os linfonodos cutâneos. Notavelmente, centro germinativo, a população de células B é quase exclusivamente (~ 95%) composto de células derivadas do compartimento do non-564Igi, e estas células B selvagem-tipo-derivado tornaram auto-reativas. Portanto, o modelo permite uma abordagem de ‘plug-and-play’ para análises de pilhas de B do centro germinativo auto-reativas usando vários transgenes, nocautes e repórteres. Aqui, descrevemos o procedimento para a geração de quimeras misturadas com centros germinativos auto-reativas espontânea, povoados por linfócitos carregando o repórter PA-GFP. Usando estratégias de rotulagem in vivo, centros germinativos único podem ser visualizados em tecidos linfoides explantados e seus constituintes celulares fotoativados usando um microscópio de dois fotões. Fotoativados linfócitos de centros germinativos único podem ser posteriormente analisados por citometria de fluxo ou classificados pelo fluorocromo-ativado da pilha (FACS) de classificação e submetidos a análises adicionais de moleculares e funcionais a jusante. A capacidade de analisar auto-reativas linfócitos de centros germinativos único diretamente pode ser aplicada para fornecer insights renovadas no campo de auto-imunidade, mas as técnicas e abordagens descritas além disso podem encontrar aplicações relevantes em estudos de doenças infecciosas e metástases de tumor.
Um grande número de modelos murino de auto-imunidade está disponível, muitos dos quais presentes com centros germinativos espontânea16. No entanto, muitos dos modelos disponíveis abrigam fundos genéticos complexos ou mutações em centrais reguladores da proliferação de linfócitos ou ativação, tornando-as mal adaptado à intercrossing com linhas de repórter e estudos de comportamento normal dos linfócitos em auto-imunidade, respectivamente. O presente modelo, pelo contrário, permite uma abordagem de ‘plug-and-play’ para análises aprofundadas de células de centro germinativo selvagem-tipo-derivado B auto-reativas usando qualquer combinação desejada de transgenes, nocautes e repórteres, no presente caso representado por photoactivatable GFP. Usando estratégias de rotulagem in vivo, centros germinativos único podem ser visualizados em tecidos linfoides explantados e seus constituintes celulares fotoativados usando um microscópio de dois fotões. Fotoativados linfócitos de centros germinativos único podem então ser analisado ou classificada de fluxo cytometrically, como células únicas ou a granel. Estas células posteriormente podem ser submetidas a análises moleculares e funcionais a jusante adicionais para fornecer insights renovadas no campo de auto-imunidade.
Existem alguns passos críticos para o desempenho bem sucedido deste procedimento. Como demonstrado pelos resultados representativos, a irradiação (1.100 Rad) e reconstituição de medula óssea do doador substituir com sucesso o compartimento de destinatário da medula óssea, rendendo quase completa quimerismo no compartimento da pilha de B. Este é um ponto importante, como as células B destinatário-derivado residuais tornaria um subconjunto da população centro germinativo ‘dark’. Independentemente da fonte usada para a irradiação, o timing/dose de irradiação tem que ser otimizado para produzir o efeito máximo mieloablativo com dano tecidual colateral mínimo aos animais. Para reconstituição, o protocolo de esmagamento de osso e reconstituição com 20 milhões de células de doador total foi encontrado para produzir robustamente graus elevados de reconstituição. Trabalhar estéril e fria/no gelo para a extração de medula óssea garante alta viabilidade da doação de medula. Para alcançar o desejado doador rácios de medula óssea, é essencial ter um cuidado grande quando contando alíquotas das células, tanto para a contagem em si e quando estiver retirando a subamostra de medula óssea para a contagem. Mistura e granulação co os tutanos de doadores, em vez de centrifugação e resuspending separadamente e depois misturar, servem para evitar qualquer distorção em rácios de doador após a contagem de células.
A geração de Quimera mista da medula óssea do protocolo pode ficar sozinha, e permite a geração de quimeras com centros germinativos auto-reativas com qualquer repórter desejado, transgene ou mata-mata. No entanto, uma limitação para isso é a necessidade de usar histocompativéis doadores. A tensão de 564Igi é sobre um fundo de congenic C57Bl/6J e como consequência, os outros doadores e beneficiários devem ter um fundo de congenic H-2b (ou alternativamente, a estirpe de 564Igi deve ser traçada para a estirpe desejada e o fenótipo auto-imune verificado no novo plano de fundo). O procedimento de irradiação tende a favorecer um ambiente de tolerogenic17, e incompatibilidades em alguns antígenos de histocompatibilidade menores podem ser toleradas. No entanto, este aspecto deve ser considerado cuidadosamente, particularmente se mistura doadores masculinos e femininos e/ou destinatários, devido ao potencial de reatividade feminino com Y-antígenos macho-restrito.
Da mesma forma, o aspecto de fotoativação do protocolo pode estar sozinho e pode ser usado em muitos contextos diferentes. No entanto, o repórter PA-GFP está disponível apenas com o promotor UBC, que é ativo em todas as células hematopoiéticas linhagem, mas não em células do estroma. Como mencionado na introdução, outros photoactivatable, photoswitchable ou photoconvertible repórter estirpes estão disponíveis e podem ser substituídas por PA-GFP, com ajustamento adequado das condições experimentais.
É importante evitar photoactivation inadvertida de áreas indesejáveis, mantendo-se o laser bem acima de 900 nm quando de imagem, como esta vontade de comprimento de onda não Fotoativar PA-GFP. Para o photoactivation propriamente dito, configurações específicas, tais como laser tempo de interrupção de energia e pixel, vão depender da profundidade do tecido, o tecido específico usado e o sistema da imagem latente, e cada aplicativo tem que ser otimizado para o sistema de imagem específico usado. Tenha cuidado para não Fotodano as células, mas é ao mesmo tempo essencial para obter o photoactivation eficiente em toda a pilha, a fim de obter uma representação suficiente de células ativadas por análises a jusante. Centro germinativo B células geralmente constituem em qualquer lugar de 0,5% de ~ 2% das células do linfonodo esplênica ou cutânea B, e como pode ser visto nos resultados representativos (Figura 5), fotoativados único centro germinativo B células podem fazer ~ 1% do total população presente em uma fatia de baço único. Portanto, análise bem sucedida ou classificação de um número significativo de células requer um grande número de eventos de processamento.
The authors have nothing to disclose.
SE Degn é um companheiro de Lundbeckfonden e um sujeito distinto de fundação de Carlsberg. Este trabalho foi financiado em parte adicionalmente por um Grant biomédica NNF (SE Degn).
Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | – | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | – | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
PBS | Sigma | d8537 | |
Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91197-00 | |
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST – Fine Science Tools | 91460-11 | |
Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |