Bereitstellung von einzelligen Empfindlichkeit, eignet sich in Echtzeit Durchflusszytometrie einzigartig, multimodale Rezeptor Funktionen von lebenden Kulturen zu quantifizieren. Mit Erwachsenen neurale Vorläuferzellen, wurde die P2X7-Rezeptor-Funktion über Kalzium Zustrom von Kalzium Indikatorfarbstoff transmembranen Porenbildung durch Interkalation Bromid Aufnahme und Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen Phagozytose erkannt bewertet.
Leben-Zelle Durchflusszytometrie wird zunehmend unter Zellbiologen verwendet, um biologische Prozesse in einer lebendigen quantifizieren Zellkultur. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, wobei live-Zelle Durchflusszytometrie nach erweitert wird, um die vielfältigen Funktionen der P2X7-Rezeptor-Aktivierung in Echtzeit zu analysieren. Mit einem Zeit-Modul installiert auf einem Durchflusszytometer, werden Leben Zellfunktionalität bewertet und über einen bestimmten Zeitraum die Kinetik der Kalzium-Zustrom, transmembranen Porenbildung und Phagozytose erkunden aufgetragen. Diese einfache Methode ist vorteilhaft, da alle drei kanonische Funktionen des P2X7-Rezeptors mit einer Maschine beurteilt werden können, und die gesammelten Daten, die im Laufe der Zeit aufgetragen Informationen über die gesamte live-Zell-Population als einzellige Aufnahmen oft bietet mit technisch anspruchsvollen Patch-Clamp-Verfahren erzielt. Calcium Zustrom Experimente verwenden ein Kalzium-Indikatorfarbstoff, P2X7 Pore Formation Assays basieren zwar auf Interkalation Bromid durfte passieren die transmembranen pore auf hohe Agonist Konzentrationen gebildet. Gelb-grün (YG) Latex Perlen werden genutzt, um die Phagozytose zu messen. Spezifische Agonisten und Antagonisten werden angewendet, um die Auswirkungen der P2X7-Rezeptor-Aktivität zu untersuchen. Individuell, können diese Methoden geändert werden, um quantitative Daten auf beliebig vielen Calciumkanäle und Purinergic und Scavenger-Rezeptoren zur Verfügung zu stellen. Zusammengenommen, heben sie hervor, wie die Verwendung von Echtzeit-live-Cell-Durchflusszytometrie ist eine schnelle, kostengünstige, reproduzierbare und quantifizierbare Methode, P2X7-Rezeptor-Funktion zu untersuchen.
Das Studium der Purinergic signalisieren ist breit und vielfältig, mit zellulären Physiologie, Biochemie und Pharmakologie. Purinergic signalisieren engagiert sich in einer unendlichen Anzahl von zellulären und molekularen Prozesse, die von Krebs und Zellzyklus-Regulation, Zell-Zell-Kommunikation und Stammzellbiologie; als solche, gibt oft es ein Potenzial zu modulieren, Purinergic signalisieren für einen therapeutischen Nutzen. Der Purinergic Rezeptoren erhielt P2X7 Rezeptor erhebliche Aufmerksamkeit in den letzten Jahren aufgrund seines Potentials als ein therapeutisches Ziel für zahlreiche entzündliche Bedingungen1. Methoden für den Rezeptor zu studieren haben sich entwickelt und angepasst worden, im Laufe der Jahre um diese Forschung2,3,4,5zu erleichtern. Hier beschreiben wir eine Leben-Zelle Flow Cytometry Methode um die vielfältigen Funktionen von P2X7-Rezeptoren im Erwachsenen neurale Vorläuferzellen aus der subventricular Zone (SVZ) und der hippocampalen dentate Gyrus abgeleitet zu untersuchen.
Die P2X7-Rezeptoren wurde zuerst als P2Z Rezeptor oder der “Zelltod”-Rezeptor, als seine Aktivierung mit hohen Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP) führt zur Bildung eines großen transmembrane Pore durchlässig für Moleküle bis zu 900 Da6beschrieben. Dies führt zu Zellskelett Neuordnung transmembranen Porenbildung und potenziell, Apoptose und Nekrose7. Traditionell wird diese Funktion des P2X7 durch die Aufnahme von hohem Molekulargewicht Farbstoffe wie YO-PRO-1 oder Interkalation Bromid, quantifiziert, die fluoreszieren, wenn mit DNA-3,8eingelagert. Platte Leser Methoden, die rasche und upscaling ermöglichen, erlauben in der Regel nicht für die Beobachtung der Kinetik. Die hier beschriebene Methode basiert auf Interkalation Aufnahme und ermöglicht die Erhöhung der Fluoreszenz, im Laufe der Zeit bietet eine größere Tiefe der Informationen in Bezug auf die Geschwindigkeit der Porenbildung zu beachten gilt. P2X7-Rezeptoren wurden da gezeigt, um eine Reihe von Ergebnis Funktionen mit unterschiedlichen Antworten je nach Belichtung Zeit und Agonist Konzentration9,10zu erleichtern. Kurze Aktivierung durch geringere Konzentrationen von ATP führt für die Zwecke der Neurotransmitter und Signal Transduction11kation Zustrom. Mit Durchflusszytometrie um zu messen, Kalzium Zustrom überwindet die Probleme im Zusammenhang mit schwerfällig und technisch anspruchsvolle Methoden – insbesondere patch Spannen um nach innen Ströme zu messen, die wertvolle über die Veränderung der Potenziale in Angaben eine Zellmembran erlauben jedoch nicht für die Bevölkerung Analyse2. Die dritte Funktion des P2X7-Rezeptoren tritt in der Abwesenheit von ATP, wo P2X7-Rezeptoren, zur Erleichterung der Phagozytose in das Immunsystem und das Nervensystem9,12,13 nachgewiesen haben. Fortschritte in der Mikroskopiertechniken haben die Visualisierung des Zytoskeletts Umstellungen während der Aufnahme-Prozess erlaubt, obwohl Quantifizierung und Bevölkerung Analyse nach wie vor eine Herausforderung darstellen kann.
Die live-Zelle Flow-Zytometrie-Methode hier ermöglicht die Untersuchung alle drei Hauptfunktionen des P2X7-Rezeptoren in Echtzeit. Die Einbeziehung eines Zeit-Modul-Geräts auf das Durchflusszytometer ermöglicht Temperatur-Kontrolle und ständige rühren von Zellen in Suspension. Agonisten und Antagonisten Reize können innerhalb einer Sekunde, so dass die in der Nähe von unterbrechungsfreie Messung der zellulären Antwort geliefert werden. Dies stellt eine schnelle und einfache Methode, um reproduzierbar Funktion unter Vermeidung der Verwendung mehrerer Assay-Systeme zu quantifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll kann problemlos an jeden Zelltyp angepasst werden und verwendet werden, könnte um andere Rezeptor-Subtypen, die angesichts der Aufnahme der spezifischen Agonisten oder Inhibitoren, je nach ihren Eigenschaften zu untersuchen.
Dieser Beitrag stellt ein detailliertes Protokoll zur Analyse von P2X7-Rezeptor-Funktion in neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen von den Erwachsenen neurogenen Nischen abgeleitet. Die Einsatzmöglichkeiten für Erwachsene neuronalen Vorläuferzellen Zellen reichen von Forschung zu therapeutischen Zwecken, und die Methode der Kultur muss also robust und reproduzierbar. Es gibt eine Reihe der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls, die die Qualität der Endpunkt Kultur auswirken können. Nach dem Entfernen aus dem Schädel, Gehirn darf nicht zum Trocknen und die Dissektion sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Besonders mit dem Hippocampus führt überlegen Stammvater Zelle Erträge zusätzliche Sorgfalt, Blutgefäße oder häutigen Gewebe zu entfernen. Die Dissoziation und Zerreibung Prozess kann die Anzahl der Kugeln in einer Kultur erhalten stark auswirken; rühren das Gewebe während der Inkubation mit Trypsin-EDTA wird eine homogenere Lösung führen. Die Verwendung eines Glases feuerpolierte Weide Pipette über ein P1000 Kunststoff Pipettenspitze sehr empfehlenswert, um Zelltod zu reduzieren und verbessern die resultierende Kultur. Vermeiden Sie overtriturating. Trotz dieser Vorkehrungen erstellen der Prozedur eine Menge Trümmer in der P0-Kultur, und zur Vermeidung von Vorläuferzellen zu verlieren, waschen oder füttern die Kultur sollte vermieden werden, bis Kugeln gebildet haben.
Eine Reihe von Unterschieden zwischen der Hippokampus und SVZ Kulturen werden offensichtlich an P0. Hippocampale Kulturen ergeben weniger Kugeln, und diese in der Regel einzuhalten. Verwenden Sie eine Pipettenspitze vorsichtig abheben die Kugeln für den ersten Durchgang. Anhaftende Kugeln wurden in nachfolgenden Passagen nicht beobachtet. Verschiedene Marken von Gewebe Kulturflaschen können dazu führen, dass die Sphären besonders hippocampal Sphären zu halten und zu wachsen als Kolonien auf der Unterseite der Schale. Dies konnte nicht gefunden werden, um keine nachgeschalteten Ergebnisse für dieses Protokoll zu ändern aber sollten überwacht werden, und Konsistenz beibehalten werden sollte, wenn möglich.
Bisherige Methoden zur Messung der P2X7-Rezeptor-Funktion, wie z. B. Patch Spannen um Kalzium Zustrom aufzuzeichnen sind zeitaufwändig und mühsam und können nur auf eine einzelne Zelle Informationen. Dieses Protokoll stellt eine schnelle und reproduzierbare Methode, um alle drei Hauptfunktionen des P2X7-Rezeptoren mit einer Maschine zu analysieren. Zeitaufgelöste Leben-Zelle Durchflusszytometrie für die gesamte Bevölkerung Analyse ermöglicht und bietet den Forscher mit Informationen über die Kinetik der Kalzium-Zustrom, Porenbildung und/oder phagocytic Funktion. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie leicht als eine Methode zur Bewertung von Marker Expressionsmuster und Bevölkerung Analyse basierend auf Größe oder Protein Ausdruck Zelle verwendet werden.
Wenn Sie diese Experimente durchführen, können Unterschiede in der maximalen Kalzium Zustrom, Interkalation Aufnahme oder Phagozytose Preise zwischen Wiederholungen beobachtet werden. Um hierzu die Kugelgröße zu minimieren müssen Kulturbedingungen und Futterregime konsistent sein wie die Gesundheit der Zellen einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Die Zeit auf Eis kann auch Einfluss auf die Daten, also stellen Sie sicher, alles ist vor der Zeit vorbereitet, so dass die Zeit auf dem Eis minimal ist. Sicherzustellen Sie, dass die Kalzium-Indikatorfarbstoff Ladezeit entspricht. Ein weiterer Faktor, der zu großen Unstimmigkeiten bei der maximalen Kalzium Aufnahmen führen kann ist die Variation zwischen ATP Chargen. Die Vorbereitung der ATP-Vorrat ist entscheidend, und die Verwendung verschiedener Chargen für die gleichen Experimente vermieden werden. Vergleich von alten und neuen Chargen um sicherzustellen, dass die ATP im Einklang steht, wird auch empfohlen. Die Wirksamkeit von P2X7-Antagonisten möglicherweise auch Zelllinie und Batch-abhängige, also Optimierung der Inkubationszeiten und Konzentrationen erforderlich sind.
Es ist erwähnenswert, dass Kalzium Zustrom/Ausfluss ist eines der grundlegendsten und komplexen zellulären Funktionen und kann durch viele Rezeptoren vermittelt werden. Der ATP-induzierte Kalzium-Zustrom, wie ein klassisches Maß für P2X7-Kanal/Pore-Funktion, kann nicht genau wiedergeben, die wahre Funktion der P2X7-Rezeptoren kann als ATP auch P2Y Rezeptoren freizugebende intrazellulären Calcium aktivieren. In diesem Fall möglicherweise Barium ein besseres kation, anstelle von Calcium zu verwenden, da der Zustrom unidirektional16ist. Um den Beitrag von P2Y Rezeptoren im Kalzium Zustrom zu unterscheiden, können Bedingungen wo 1 mM EDTA oder Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-Tetraacetic Säure (EGTA) K+ Mediums anstelle von CaCl2 hinzugefügt wird in diesem verwendet werden Assay.
Dieses Protokoll kann auch leicht andere Zelltypen angepasst angepasst werden und kann für die Untersuchung der Funktionalität der Alternative Ionen-Kanal Rezeptoren oder Rezeptoren, die Teilnahme an Phagozytose nützlich sein. Diese Methode kann auch zu einer Flow Cytometry Maschine ohne ein Zeit-Modul angepasst werden. Als Beispiel können Phagozytose Assays erfolgen, wo YG Perlen 7 – 8 min. vor der Analyse von konventionellen Durchflusszytometrie hinzugefügt werden. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C zu und kontinuierlich wirbeln sie. Dies wird nicht in Echtzeit Informationen aber Unterschiede in die mittlere endgültige Fluoreszenz werden noch informieren, des Forschers über die Funktionalität des P2X7-Rezeptoren.
Interesse an P2X7-Rezeptoren wie ein Medikament Ziel21,22 oder sogar als ein Drug-Delivery route23,24 wächst rasant und so Methoden, um dieses rätselhafte Rezeptor studieren müssen kontinuierlich angepasst und verbessert werden erleichtern Sie diese Studien. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die verwendet werden, um Erwachsenen neurale Vorläuferzellen P2X7 Funktion zu untersuchen, und es ist zu hoffen, dass erreichen ein besseres Verständnis des P2X7-Rezeptoren in den neurogenen Nischen zu Fortschritte in der Behandlung des Schlaganfalls führen kann und andere ischämischen Verletzungen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten danken Maria Kasherman und Xin Huang für ihre Beiträge zu dieser Forschung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation, M.W., T.C.L. und m.l. und T.C.L. aus der National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australien (571100 und 1048082) und die gemeinnützige Stiftung Baxter (unterstützt. Sydney, Australien). B.g. wurde von der Australian Research Council (ARC) Zukunft Fellowship (FT120100581), NHMRC Projektzuschüsse (1048082, 1061419 und 1120095) und der Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support Grant Florey Institute unterstützt. M.l. wurde durch einen Charles D. Kelman, M.D. Postdoctoral Award (2010) von internationalen Retinal Research Foundation (USA) unterstützt.
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |