Summary

Colección de aliento de los niños para el descubrimiento de biomarcadores de la enfermedad

Published: February 14, 2019
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Summary

Este protocolo describe un método simple para la adquisición de muestras de aliento de los niños. Brevemente, las muestras de aire mezclado previamente se concentran en tubos absorbentes antes del análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas. Biomarcadores de la respiración de las enfermedades infecciosas y no infecciosas pueden identificarse mediante este método de colección de la respiración.

Abstract

Análisis y colección de respiración pueden utilizarse para descubrir biomarcadores volátiles en un número de enfermedades infecciosas y no infecciosas, como la malaria, tuberculosis, cáncer de pulmón y enfermedad hepática. Este protocolo describe un método reproducible para el muestreo de aliento en los niños y luego estabilizar las muestras de aliento para su posterior análisis con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). El objetivo de este método es establecer un protocolo estandarizado para la adquisición de muestras de aliento para su posterior análisis químico, de los niños de 4 a 15 años de edad. En primer lugar, se muestrea respiración usando una boquilla de cartón unida a una válvula de 2 vías, que está conectada a una bolsa de 3 L. Analitos de respiración se transfirió a un tubo de desorción térmica y almacenados a 4-5 ° C hasta su análisis. Esta técnica se ha utilizado previamente para capturar el aliento de los niños con malaria para la identificación de biomarcadores de respiración exitosa. Posteriormente, hemos aplicado con éxito esta técnica a las cohortes pediátricas adicionales. La ventaja de este método es que requiere mínima cooperación por parte del paciente (de valor particular en población pediátrica), tiene un período corto de la colección, no requiere de personal capacitado y se puede realizar con equipos portátiles en configuración del campo de recursos limitados.

Introduction

Biomarcadores pueden producir información valiosa sobre los procesos biológicos normales y patológicos que pueden contribuir a la enfermedad clínicamente identificable. Recientemente, ha habido interés creciente en la evaluación de volátiles de respiración como biomarcadores para una variedad de Estados de enfermedad, incluyendo infecciones, enfermedades metabólicas y cáncer 1. Espirado contiene niveles cuantificables de compuestos orgánicos volátiles (COV), compuestos orgánicos semivolátiles y microbios derivada material (por ejemplo, los ácidos nucleicos de las bacterias y virus). El objetivo central del análisis del aire espirado es profundizar en el estado de una condición médica o exposiciones ambientales en forma no invasiva. Existen varios métodos para recolectar y analizar el aire espirado, dependiendo de los componentes de interés. Actualmente no existe ningún método de colección de respiración exhalada estandarizados, que complica el análisis comparativo de resultados entre los estudios. Estandarización de procedimientos de recopilación de la respiración es esencial, como el procedimiento de muestreo sí mismo tiene un efecto considerable sobre los resultados posteriores de análisis de aliento.

En muchos estudios, muestras respiratorias respiración finales son empleada2,3. Este muestreo consiste en descartar la parte inicial del aire espirado (“espacio muerto”), con el fin de captar preferentemente el aire al final del ciclo de respiración. La ventaja de esta estrategia es que reduce los niveles de VOC exógeno (por ejemplo, COV ambiental), enriqueciendo para compuestos orgánicos volátiles endógenos, específico para cada paciente. Este método excluye a los primeros segundos de exhalación de un individuo antes de tomar la muestra de aliento. Otros investigadores han utilizado un sensor de presión para activar el muestreo durante la fase de predefinidos de vencimiento4,5. Porque los sensores de presión requieren compleja ingeniería, este método alternativo requiere un dispositivo de muestreo dedicado y relativamente costosos.

Muestreo de respiración pediátrica puede ser particularmente difícil. Una preocupación fundamental es que los niños pequeños no puede cooperar con protocolos para la espiración voluntaria del aire de “dead space”. Por esta razón, es más fácil obtener mezcla respiratoria respiración de los niños. Sin embargo, una advertencia importante con muestras mixtas respiración respiratoria es el riesgo de contaminación ambiental y material. Por lo tanto, la viabilidad de colección pediátrica es una preocupación de conducción en el campo.

Además de los métodos de recopilación, almacenamiento de muestras de aliento también puede influir la calidad de la muestra. La humedad alta en aire exhalado y las concentraciones bajas (partes por billón) de respiración orgánicos volátiles compuestos hacen muestras de aliento especialmente susceptibles a problemas relacionados con el almacenamiento6,7. A pesar del gran potencial de técnicas en tiempo real como protón transferencia reacción espectrometría de masas (PTR-MS), GC-MS sigue siendo el gold standard para el análisis de muestras de aliento. Análisis por GC-MS de muestras de aliento es una técnica fuera de línea, es junto con métodos de preconcentración como tubos de desorción térmica (TD), micro-extracción en fase sólida y dispositivos de la trampa de la aguja. Antes de la concentración, las muestras de aliento necesitan almacenarse temporalmente en polímero bolsas8. Bolsas de polímero son populares debido a su precio moderado, relativamente buena durabilidad y reutilización. Mientras que las bolsas se pueden reutilizar, tiempo y esfuerzo se requieren para asegurar la eficiente limpieza de7,8. Cada tipo de bolsa específica también requiere procedimientos empíricamente determinados y estandarizados de control de calidad, reutilización y recuperación.

Tubos de TD son ampliamente utilizados para la concentración la respiración porque captura a una gran cantidad de volátiles y se pueden personalizar. Los materiales absorbentes usados para embalar tubos de TD se pueden adaptados a aplicaciones particulares y objetivo particular volátiles de interés. Tubos de TD substancialmente mejorar la comodidad de los estudios de biomarcadores de la respiración, especialmente en sitios remotos, porque TD tubos con seguridad tienda volátiles de la respiración durante al menos dos semanas y son fáciles de transporte3.

En un esfuerzo por estandarizar la colección respiración pediátrica para el descubrimiento de biomarcadores, aquí describimos un método simple para recoger el aliento de los niños pequeños. Para ilustrar los resultados representativos de los protocolos implementados, se presentan datos desidentificados de una cohorte en curso de niños (8-17 años) sometidos a evaluación para la enfermedad sin alcohol ácido graso hígado (EHGNA). Resultados y análisis de este estudio serán denunciados en una posterior publicación. En este trabajo se presenta un subconjunto de datos para demostrar la aplicación de nuestro protocolo. En Resumen, los niños sean instruídos que exhale normalmente a través de la boquilla en una bolsa de polímero, como si “sopla un globo”. El proceso se repite 2 a 4 veces hasta que se recogió 1 L de aire. La muestra es entonces transferida a un tubo de TD y almacenada a 5 ° C antes del análisis por GC-MS.

Protocol

El estudio ha sido aprobado por la institucional Review Board de Washington University School of Medicine (#201709030). El consentimiento informado fue obtenido de un padre o tutor legal antes de la inclusión en el estudio. Fotografías en la figura 2 se reproducen con el consentimiento informado de los padres. 1. Asamblea de aliento sampler Utilizando guantes desechables, instale una boquilla de cartón en el sampler de la respiración, como se muestra…

Representative Results

En nuestro estudio, respiración se colectaron muestras de 10 niños (8-17 años) sometidos a evaluación en el Hospital infantil de St. Louis. Las muestras de aliento y muestras de aire ambiente (n = 10) fueron recogidos como se describió anteriormente. Muestras fueron analizadas mediante cromatografía de gases cuadrupolo tiempo de vuelo espectrometría de masas (GC-MS-QToF) y desorción térmica, como se describió previamente9. Después de la eliminac…

Discussion

A pesar de progresos considerables en la investigación de la respiración durante la última década, las prácticas estándares para el muestreo y análisis de volátiles del gas de respiración siendo indefinido10. La razón principal de esta falta de estandarización ha sido la diversidad de métodos de recolección de la respiración, que tienen impacto directo sobre la diversidad química resultante en cualquier muestra dada respiración exhalada. Aliento exhalado contiene una amplia gama de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Expresamos nuestro agradecimiento a los niños y familias del Hospital de St. Louis los niños que participaron en este estudio. Reconocemos los esfuerzos únicos de la Sra. Stacy Postma y Sra. Janet Sokolich durante la colección de la respiración. Este trabajo es apoyado por la Fundación del Hospital infantil de St. Louis.

Materials

Breath bag  SKC 237-03 These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece  A-M systems 161902 0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing Cole Parmer 95802-11 Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps  Markes International C-CF010 Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter Charlotte Pipe 2109 Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon) In-house built Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump SKC 220-1000TC-C Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing  Supelco 20533 Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) 
Thermal desorption tubes  Markes International C2-CAXX-5314 Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool Markes International C-CPLOK
Two-way ball valve connector  Homewerks Worldwide VBV-P40-E3B Part 2/3 of breath connector (1/2")

References

  1. Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
  2. Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
  3. Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
  4. Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
  5. Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
  6. Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
  7. Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
  8. Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
  9. Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
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  12. Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?. Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).

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Cite This Article
Berna, A. Z., DeBosch, B., Stoll, J., Odom John, A. R. Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery. J. Vis. Exp. (144), e59217, doi:10.3791/59217 (2019).

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