С помощью снайпера Cas9 для сведения к минимуму последствий пробить ТРИФОСФАТЫ Cas9 без потери на цель деятельности через направленной эволюции

1. Интеграция человека ГОЙ в штамм E. coli BW25141 Клонирование ГОИ Полимеразной цепной реакции (ПЦР) усиливают длиной 500 bp человека ГОИ , содержащих различные сайты целевой кандидата через стандартные методы PCR с праймерами, содержащих Ноти и XhoI энзима ограничения сайтов.Примечание: В этом эксперименте, ГОИ был человеческого гена EMX1 . Дайджест продукт PCR и pgrg3613 вектор с энзимами ограничения Ноти и XhoI. Гель Очистить желаемого фрагменты (500 bp и 12 КБ). Перевязать фрагменты, вместе с помощью лигаза T4. Для этого смешайте 50 нг усваивается pgrg36 и 6 ng вставки PCR в реакции объем 20 мкл, содержащие 1 x лигаза буфер и 0,5 U лигаза фермента. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре (RT). Превратите перевязаны плазмида DH5-α-компетентных клеток. Расти в результате трансформантов на плиты агара Лурия бульон (LB), содержащий ампициллина (100 мкг/мл) при температуре 32 ° C и инкубировать на ночь. Подобрать колонии и вырастить его в средствах массовой информации LB, содержащий ампициллина на ночь. Изолируйте плазмидной ДНК от кишечной палочки, использование коммерчески доступных алкалический Kit. Подтвердите вставки фрагмента ГОИ Сэнгером секвенирования плазмида, полученные от мини-плазмида подготовки (мини-prep)13. Подготовка BW25141 -ГОИ Преобразуйте полученные pgrg36 -ГОИ плазмида в штамм E. coli BW25141. Важно использовать штамм BW25141 для того, чтобы свести к минимуму число ложных положительных колоний. Растут в трансформированных клеток в буфере фунтов на 32 ° C на ночь. ГОЙ вставляется в геномной ДНК штамма BW25141 (BW25141 -ГОИ). Удаление плазмидаГОЙ pgrg36 – из штамма BW25141 -ГОИ , используя стандартные pgrg36 протокол13. Кратко, разбавить колонии (приблизительно 107-фолд) и вырастить его на плите фунтов при 42 ° C ночь. Полоска колоний на пластину LB и расти их при 42 ° C на ночь. Подтвердите правильность подсоединения ГОИ колонии PCR, используя праймеры, предложил в протоколе pgrg36: 5′-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 “и 5′-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3». Грунтовка усиливает геномной ДНК вставки сайте, и размер конечного продукта PCR будет 904 bp плюс размер вставки (500 bp в данном случае). Подготовка electrocompetent BW25141 -ГОИ клетки (подробный протокол описан в 3.2.6–3.2.10 шаги). 2. Подготовка вариант библиотеки Cas9 Подготовка библиотеки Преобразование векторных Cas97 в коммерческих E. coli мутатора штамм (Таблица материалов) и следуйте инструкциям производителя, чтобы получить вариант Библиотека (коммутатор). Выполните ошибкам ПЦР на всей последовательности WT Cas9 в Cas9 vector, используя набор ошибок ПЦР (Таблица материалов).Примечание: Низкий-погрешность протокол был принят в случае снайпер-Cas9 во избежание подрыва оригинальной функции белка. Дайджест Cas9 вектор с соответствующим энзимами ограничения. Гель очистить продукт PCR (из шага 2.1.2) и переваривается позвоночника.Примечание: Размер SpCas9 гена составляет около 4.3 КБ. XhoI и KpnI были выбраны переваривать вектор pBLC-SpCas9, который был использован в случае снайпер-Cas9. Соберите костяк фрагмента (из шага 2.1.3) и вставка, усиливаются с помощью ошибкам ПЦР (из шага 2.1.3) через изотермический в vitro рекомбинации.Примечание: более 500 нг позвоночника необходимо получить высокую концентрацию библиотеки (библиотека ошибкам PCR [EP]). Два различных ошибок наборы PCR были использованы для подготовки EP библиотек в случае снайпер-Cas9 (EP библиотека I и II). Очистить товары из Ассамблеи (от шага 2.1.4) с помощью ДНК очистка kit, который позволяет низким объемом элюции (Таблица материалов). Элюировать с 6 мкл нуклеиназы свободной воды (НЗФ) и измерения концентрации ДНК. Преобразование более чем 500 ng вектора Cas9 библиотеки (для каждого из трех библиотек) в 50 мкл клеток E. coli electrocompetent (Таблица материалов). Смотреть протокол электропорации в 3.2.1-3.2.4 шаги. Для подготовки этой библиотеки используйте 1 мл SOC среды вместо 250 мкл 50 мкл компетентных клеток. Сделать масштаба 1: 100, 1:1, 000 и мэм разведения смеси, содержащей восстановленные клетки с SOC среднего. Пластина разреженных клетки на 100 мм LB плиты агара дополнена Хлорамфеникол (12,5 мкг/мл). Пластина оставшиеся ячейки на плите2 245 мм. Инкубируйте при 37 ° C на ночь. Расчет библиотека сложности Фотография пластины разрежения через систему документации гель или обычный цифровой фотоаппарат. Запуск программного обеспечения OpenCFU14 и загрузить фотографии разбавления пластин. Установите подсчета область внутри тарелку и удалить ложные колоний. Вручную умножьте количество колоний на коэффициент разбавления, чтобы получить оригинальный номер трансформантов. Преобразуйте эти цифры в логарифмической форме (основание 10). Вычисление среднего значения для определения сложности библиотеки. Когда значение требуемой сложности получается, собрать всех колоний на пластину площадь 245 мм (от шага 2.1.7) с использованием разбрасывателя и 20 мл фунтов с хлорамфениколом. Не растут собрались колоний и очищения плазмиды библиотеки с использованием коммерческих midiprep комплекта.Примечание: Чем выше сложность Библиотека, тем лучше. Когда был определен снайпер-Cas9, разнообразие 3 х 106 было достигнуто для каждой библиотеки. 3. положительные и отрицательные скрининга для эволюции Cas9 Выбор цели и плазмиды строительство Выберите целевой sgRNA прокладку последовательность в ГОИ. Замените один или два остатков в случайных нуклеотидов производить несоответствие последовательности.Примечание: Человека EMX1 целевого сайта 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA с Пэм GGG) был использован в случае снайпер-Cas9. Объяснения являются несовпадающими последовательности, используемые: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA и GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA. Вставьте несоответствие последовательности (см. шаг 3.1.1) в sgRNA плазмиду с использованием стандартных олигонуклеотида (oligo) клонирования процедуры7. Вставьте несоответствие последовательность с PAM в конце 3′ p11-Лейси wtx1 (Таблица материалов) для построения с помощью стандартных oligo клонирования процедуры15плазмида ccdB . Подготовка компетентных клеток снайпер скрининг E. coli Потепление BW25141 -ГОЙ electrocompetent клеток на льду. Добавить 1 нг плазмида ccdB и sgRNA плазмиду с двойной несоответствия в 50 мкл талой BW25141 -ГОИ клеток. Аккуратно перемешать клетки, закупорить и переместить их в кювет электропорации prechilled 0,1 см. Преобразуйте E. coli с двумя плазмид через электропорации. Добавьте 250 мкл SOC среды сразу же после электропорации. Аккуратно Пипетка решение сочетание клетки и среды. Передача смеси пробки microcentrifuge 1,5 мл.Примечание: Для достижения максимальной эффективности, установите напряжение на 1,80 кв и среда выполнения должна быть между 4.8 МС и 5.0 мс. Восстановление трансформированных клеток и инкубировать их в 32 ° C в течение 1 ч с нежным встряхивания. Пластина 125 мкл восстановленные клеток на ампициллин (50 мкг/мл) / канамицин (25 мкг/мл) LB агар пластины (культура условие). Пластина остальные клетки на ампициллин/канамицин/арабинозы (1,5 мг/мл) плита агара фунтов (ccdB-выражая условие). Инкубируйте на 32 ° C на ночь. Проверка на отсутствие Выжившие колонии на ccdB-выражая условие пластины. Соберите колоний от культуры состояния пластины с помощью спредера и культуры их в 250 мл среды супер оптимального бульон (SOB), дополнены 50 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицин на 32 ° C, с нежной встряхивания. Когда оптической плотности на 600 Нм (600OD) достигает 0.4, холод колбу на льду. Подготовка prechilled деионизированную воду и раствор prechilled 10% глицерина (стерилизовать перед использованием). Центрифуга (на 4000 x g 5 минут при температуре 4 ° C) клетки и удалить супернатант. Добавьте 200 мл prechilled деионизованной воды. Ресуспензируйте клетки с помощью Пипетки серологические 10 мл. Повторите этот шаг 3 x. Вымойте клетки с 50 мл раствора prechilled 10% глицерина. Центрифуга для них как раньше (на 4000 x g 5 минут при температуре 4 ° C). Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 300 мкл 10% раствором глицерина. Сделать 50 мкл аликвоты и заморозить их в жидком азоте. Хранить клетки (снайпер скрининг)-80 ° c. Снайпер скрининг Трансформировать клетки снайпер скрининг (от шага 3.2.10) с 100 нг вариант плазмид Cas9 от каждой библиотеки (с шагом 2.2.3.See шаги 2.1.1 и 2.1.4). Следуйте указаниям электропорация, описанные в шагах 3.2.1–3.2.3. Передать 250 мкл клетки пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл. Добавление УВД сделать окончательный концентрацию 10 нг/мл, 250 стр. Восстановите как ATC-содержащих и ATC-свободной клетки (см. шаг 3.2.4 для этапа восстановления). Тарелка 25 мкл восстановленные ATC-свободных клеток на плите агар хлорамфеникол/канамицин фунтов (неселективных условие). Добавление УВД восстановленные ATC-содержащих клеток, чтобы сделать окончательный концентрации 100 нг/мл на плиту LB 245 мм. Сразу же пластины клетки на хлорамфеникол/канамицин/арабинозы плиту LB агар (селективный условие). Инкубируйте на ночь на 32 ° C.Примечание: Размер и количество фунтов плиты определяется размером разнообразия крышек скрининга. В случае 100 мм Петри с 20 мл LB добавьте 2 мкг УВД. Фотография пластины. Подсчитать количество жизнеспособных колоний, с использованием программного обеспечения OpenCFU14. (См. шаг 2.2.1) Убедитесь, что количество колоний на пластину неселективных по крайней мере 10 x больше разнообразия в библиотеку, чтобы охватить все варианты. Рассчитайте частоту выживания следующим образом.Выживание частота = количество колоний на выборочной плита / (количество колоний на неселективных плите x 10) Бильярд колоний, которые сохранились на избирательное пластины из всех трех библиотек. Инкубируйте Выжившие колонии в 250 мл LB среды дополняется 12,5 мкг/мл хлорамфеникол при 42 ° C на ночь. Изолируйте экранированной Cas9 библиотеки ДНК с помощью комплекта midiprep.Примечание: Этот шаг очищает sgRNA плазмиды. Повторите процесс отбора от 3.3.1–3.3.6 шаги до тех пор, пока частота выживания достигает плато. Использование 10 нг выбранного плазмида Cas9 для преобразования и 10 нг/мл УВД во время восстановления. Поддерживать концентрацию УВД на 100 нг/мл для селективного состояния. Тасование и второй скрининг Перемешивание выбранного пула варианты, используя следующий протокол Перетасовка ДНК. PCR усиливает Cas9 вставить в Cas9 плазмиду с помощью фланкируя грунтовки, 150 нуклеотидов от границ, вставка. Дайджест 2 мкг усиливается ПЦР продукта с DNase I 1 мин при 37 ° C. Очищайте фрагменты 70 – 200 bp в длину, с использованием 2% геля агарозы. PCR усиливает очищенный фрагментов. Использование продукта как шаблон для ПЦР усиливают Cas9 вставка с соответствующей грунтовки, фланкируя Cas9. Используйте конечный продукт PCR построить библиотеку Cas9, как описано в шаге 2.1.4. Подготовить новые снайпер скрининг клетки (см. раздел 3.2) с другой несоответствие sgRNA плазмиды (см. шаг 3.1.1). Повторить процесс отбора (разделы 3.2-3.3) до выживания ставка достигает плато. Использование 10 нг выбранного плазмида Cas9 для преобразования и 10 нг/мл УВД во время восстановления. Поддерживать концентрацию УВД на 10 нг/мл для селективного состояния. Выбор развивались Cas9 мутант плазмиды После последнего шага скрининга случайным образом выбрать сто колоний от селективного пластины и культура их в хлорамфеникол содержащих LB среде при 42 ° C на ночь. Изолируйте с помощью процедуры алкалический и Сэнгер последовательности вставки с помощью последовательности грунтовки в течение Cas9 плазмид. Выберите Топ три наиболее частых вариантов для их проверки в линий клеток человека. 4. Доставка Cas9 как RNP с усеченной sgRNA Выбор цели гена с помощью Cas-OFFinder Выбор целевых сайтов с Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Выберите подходящие для конкретного типа Cas9 и геном целевой тип PAM (человека, мышь, данио рерио, и т.д.). Заполните в закладке последовательности запроса , выбрать несоответствие номери нажмите кнопку Отправить . После того, как несколько секунд, на цели (с ‘0’, количество и несоответствия) и мимо сайты будут отображаться. В общем выбор мимо сайтов с одного до трех несоответствия. Подготовка шаблона sgRNA Заказать crRNA и tracrRNA oligos с следующие шаблон последовательности, а именно crRNA последовательность: 5′-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3′; tracrRNA последовательность: 5′-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′. Заполните crRNA последовательности с последовательности целевых объектов, полученный на шаге 4.1.2 N20. Для разработки усеченная sgRNAs, удалите баз из 5′ конца для получения последовательности sgRNA N19, N18 или N17. Подготовьте смесь ПЦР для усиления последовательности кодирования sgRNA следующим образом: объединить 10 мкл 5 x буфер, 0.5 мкл crRNA oligo (100 пмоль/мкл), 0.5 мкл tracrRNA oligo (100 пмоль/мкл), 2,5 мкл дНТФ (по 10 мм), 0.5 мкл ДНК полимеразы и 36 мкл НЗФ (таблица материалов). Усилить шаблон с помощью следующих условий, а именно, для первоначального денатурации: 1 мин на 98 ° C; для денатурации, отжиг и расширение: 10 s на 98 ° C, 15 s на 54 ° C, 20 s при 72 ° C, для 25 циклов; для окончательного расширения: 5 мин при 72 ° C. Анализ 2 мкл усиливается шаблона ДНК (от шага 4.2.3) на 2% гель агарозы. Очищайте шаблон, используя комплект для очистки ПЦР.Примечание: Размер шаблона ДНК-125 bp. Синтез sgRNA Подготовьте смесь реакции синтеза sgRNA следующим: объединить 8.5 мкл шаблона ДНК (от шага 4.2.3), 1 мкл UTP (25 мм), 1 мкл CTP (25 мм), 1 мкл GTP (25 мм), 1 мкл АТФ (25 мм), 4.2 мкл MgCl2 (100 мм) , 4.5 мкл T7 РНК-полимеразы (50 U/мкл), 3 мкл 10 буфера x T7 РНК-полимеразы, 1.2 мкл пирофосфатаза (0,5 U/мкл), 0,75 мкл АБС битор РНКазы (40 U/мкл) и 4.2 мкл НЗФ. Инкубировать реакционной смеси при 37 ° C ночь (по крайней мере за 10 h). Добавить 0,5 мкл DNase (2 U/мкл) в реакционной смеси и инкубировать при 37 ° C на 15 – 30 мин очистить sgRNA, используя комплект для очистки РНК. Чтобы уменьшить токсичность, вызванные врожденной иммунной реакции, вызванные 5′-трифосфата на sgRNA16, удалите 5′-трифосфата из руководства РНК с икры кишечной щелочной фосфатазы (CIP) следующим образом: лечить 10 мкг в vitro- транскрипции РНК с 250 U CIP 3 часа при 37 ° C в присутствии 100 U РНКазы ингибитора. Очистки CIP-лечение sgRNA, используя комплект для очистки РНК. 5. выражение протеина WT – и снайпер-Cas9 и очистки Выражение протеина в E. coli Трансформировать животных плазмид18 кодирования его меткой WT – и снайпер-Cas9 в BL21 штамм E. coli (DE3). Прививать 50 мл LB среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин с свежий колонии, укрывательство ПЭТ Cas9 выражение плазмиды и встряхните его на ночь (200 об/мин) при 37 ° C (preculture). Передача 10 мл на ночь культуры до 500 мл свежего LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицин. Инкубируйте культуры встряхивании (200 об/мин) при 37 ° C на 2 ч. Контролировать ОД600 , до тех пор, пока культура достигает середины журнала фазе роста (OD ≈600 0,6-0,7). Побудить выражения протеина WT – или снайпер-Cas9 с изопропиловым β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ, в конечной концентрации 0.25 Нм). Инкубируйте культуры при 18 ° C на ночь. Очистка белков Урожай клетки центрифугированием в 5000 x g 10 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте гранулы литического буфера (50 мм NaH2PO4, 300 мм NaCl, имидазола 10 мм, 4 мм Дитиотреитол [DTT], benzamidine 5 мм, 100 мм phenylmethylsulfonyl фторид [PMSF], рН 8) в 20 мл на грамм живого веса. Добавить PMSF, DTT и лизоцима в конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировать смесь на льду за 30 мин. Sonicate клетки на льду. Пульс неоднократно для 10 s на 200 – 300 W с 10 s, охлаждение период между каждого импульса, общее время 20 мин. Центрифуга lysate на 6000 x г за 30 мин при 4 ° C. Удалите супернатант в свежий трубку. Добавить 1 мл раствора смолы агарозы его-Bind до 5 мл очищены lysate и поколебать мягко в течение 1 ч при 4 ° C. Загрузите смесь смолы агарозы lysate/его-Bind на столбец с розеткой ограничен снизу. Снимите нижнюю крышку и собирать проточный столбца. Промойте колонку 2 x с мыть буфера (50 мм NaH2PO4, 300 мм NaCl, 20 мм имидазола, рН 8); Соберите мыть дроби для анализа натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE). Элюировать белков 10 x с 1 мл раствора Элюирующий буфер (50 мм NaH2PO4, 300 мм NaCl, 250 мм имидазола, рН 8), сбор образцов для SDS-PAGE. Концентрат белка eluted WT – или снайпер-Cas9, с помощью фильтра столбца 100 кДа. Хранение образцов в растворе трис-HCl, 150 мм NaCl и 50% глицерина 10 мм-80 ° c. 6. RNP доставки Трансфекция и подготовка клеток для доставки RNP Сохранить HEK293T клетки в Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% антибиотиков при 37 ° C с 5% CO2. Смешать WT – или снайпер-Cas9 белка (2 мкг) с sgRNA (2 мкг) и проинкубируйте втечение 10 мин на RT сделать RNP комплексов. Trypsinize и подсчитать количество ячеек. Готовить 2 х 104 ячеек на одну реакцию. Вымойте клетки с фосфат амортизированное saline (PBS) и центрифуги. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте лепешка с электропорации буфера. Electroporate RNP комплексов в клетки, используя следующие параметры, а именно: 1300 V, 30 мс и один пульс. Плита клетки на тарелку, 48-а заполнены с 500 мкл DMEM, дополненная FBS и антибиотики (как описано в шаге 6.1.1) сразу после электропорации. Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2. Изолируйте геномной ДНК с комплектом подготовки геномная ДНК, 48 ч после transfection. 7. transfection плазмид кодирования снайпер-Cas9 и sgRNA Строительство sgRNA плазмиды Заказать вперед и обратить вспять oligos с следующий шаблон последовательности, а именно вперед: 5′-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3′; обратный: 5′-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3′. Замените N20 последовательности целевых объектов, полученный на шаге 4.1.2. Укоротите последовательности длиной N19, N18 или N17 синтезировать усеченная sgRNA. Отжиг оба oligos в 1 x T4 ДНК лигаза буфера. Дайджест pRG2 вектор с BsaI энзима ограничения. Гель Очистить переваривается вектор (3300 bp) с использованием геля агарозы 0,8%. Перевязать отожженная oligo и очищенный фрагмент с помощью лигаза T4 в 37 ° C: микс 50 ng усваивается pRG2 и 1 нг отожженная oligo реакции объемом 20 мкл. Инкубируйте на RT на 15 мин. Преобразовать перешнуровки смесь в альфа-штамм DH5 и расти трансформантов на плиты агара LB, содержащий ампициллина (100 мкг/мл) при 37 ° C. Подтвердите включение oligo в векторе, стандартной виртуализации. Трансфекция плазмид кодирования снайпер-Cas9 и sgRNA Сохранить HEK293T клетки в DMEM дополнена 10% FBS и 1% антибиотиков при 37 ° C с 5% CO2. За день до трансфекции, trypsinize и подсчитать количество ячеек. При работе в масштабе 48-Ну, пластина 1 x 105 клеток на скважину в 250 мкл полный рост средних. Клетки должна быть 50%-80% притока в день transfection. В 48-ну масштабе, подготовить 250 нг p3s-Cas9 плазмиды и 250 нг sgRNA плазмиду для transfection, используя реагент на основе липидов transfection. Смешайте плазмид в 25 мкл сыворотка бесплатно MEM. Разбавьте 1 мкл Реагента трансфекции с 25 мкл сыворотка бесплатно MEM. Инкубировать смеси на RT на 5 мин объединить две смеси и инкубировать и полученный раствор в РТ за 20 мин до формы плазмида lipofectamine комплексов. После 20 минут инкубации, добавьте 50 мкл раствора, содержащего плазмида трансфекции реагент комплексы непосредственно каждому хорошо содержащие клетки и смешайте нежно покачиваясь пластину взад и вперед. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO2 инкубатора для 48-72 ч пост трансфекции перед опробование для выражения трансген. 8. Расчет indel частот для определения мероприятий на цель и мимо Целевые глубокую последовательности для анализа на цель и потенциальных-цели сайты Изолируйте геномной ДНК из шага 6.1.5 или 7.2.4 с комплектом подготовки геномная ДНК. Создания глубокой последовательность библиотек по амплификации PCR геномная ДНК с праймерами, ориентации на целевые и пробить. Используйте индекс Праймеры для обозначения каждого образца. Подвергать пуле библиотек в паре конец последовательности с помощью машины секвенирование нового поколения. Глубокая последовательности анализа с помощью Cas-анализатор Анализ данных глубокую виртуализации с помощью Cas-анализатор инструмент оценки17. Выберите файлы Fastq под вкладки Читать 1 и 2 чтение (чтение 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, читать 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq). Заполните на вкладке Основная информация и закладке Параметры анализа нажмите кнопку Отправить .