Her presenterer vi en protokoll for å analysere Aspergillus flavus vekst og aflatoxin produksjon i mais kjerner uttrykke en soppdrepende protein. Bruke en GFP-uttrykke A. flavus belastning overvåket vi infeksjon og spredning av soppen i eldre kjerner i sanntid. Analysen er rask, pålitelig og reproduserbar.
Aflatoxin forurensning i mat og fôret avlingene er en stor utfordring over hele verden. Aflatoxins, produsert av soppen Aspergillus flavus (A. flavus) er potente kreftfremkallende som betydelig reduserer beskjære verdien i mais og andre olje rike avlinger som peanut foruten posing alvorlig trussel mot mennesker og dyr sunnhet. Ulike tilnærminger, inkludert tradisjonelle avl, transgene uttrykket av motstanden forbundet proteiner og RNA-interferens (RNAi)-basert vert-indusert genet stanse kritiske A. flavus genet mål, evalueres for å øke aflatoxin motstand i utsatt avlinger. Tidligere studier har vist en viktig rolle for α-amylase i A. flavus patogenesen og aflatoxin, antyder dette genet/enzymet er et mulig mål å redusere både A. flavus vekst og aflatoxin produksjon. I denne forbindelse, ble denne studien gjennomført for å vurdere heterologous uttrykk (under kontroll konstituerende CaMV 35S ) for en Lablab purpureus L. α-amylase inhibitor som protein (AILP) i mais mot A. flavus. AILP er en 36-kDa protein, som er en konkurransedyktig hemmer av A. flavus α-amylase enzym og tilhører Lektiner-arcelin-α-amylase hemmer protein familien felles bønne. In vitro studier før arbeidet hadde vist AILP rolle i Hemming av A. flavus α-amylase aktivitet og soppvekst. Soppvekst og aflatoxin produksjon i eldre kjerner ble kartlagt i sanntid ved hjelp av en GFP-uttrykke A. flavus belastning. Denne kjernen screening analysen (KSA) er svært enkelt å sette opp og gir pålitelig og reproduserbar infeksjon og omfanget av spredning som kan kvantifiseres for evaluering av germplasm og transgene linjer. Fluorescens fra GFP stammen er nært korrelert til sopp vekst, og dermed er det godt korrelert til aflatoxin verdier. Målet med arbeidet var å implementere denne forkunnskaper i en kommersielt viktig avling som mais å øke aflatoxin motstand. Våre resultater viser en 35%-72% reduksjon i A. flavus vekst i AILP-uttrykke transgene mais kjerner som igjen oversettes til 62%-88% reduksjon i aflatoxin nivåer.
Mycotoxin forurensning av sopp slektene, Aspergillus, Fusarium, penicillinog Alternaria er et stort problem av næringen og mate avlinger vokst verdensomspennende1,2,3. Blant disse phytopathogenic sopp har Aspergillus størst ugunstig innvirkning på beskjære verdi og dyrs og helse. Aspergillus flavus (A. flavus) er en opportunistisk anlegget patogen som infiserer olje rike avlinger som mais, bomullsfrøolje og peanut og produserer potente kreftfremkallende stoffer, aflatoxins, samt mange giftige sekundære metabolitter (SMs). Mais er et viktig mat og mate avling dyrkes over hele verden og er svært utsatt for forurensning av A. flavus. Den økonomiske virkningen av aflatoxin forurensning på taper og redusert verdien i mais kan være så mye som $686.6 millioner/år i USA2 anslåtte endringer i globale klima, virkningen av aflatoxins kan resultere i større økonomiske tap i mais med estimater så høyt som $1.68 milliarder i året i nær fremtid2. Gitt de negative økonomiske og helsemessige effektene av aflatoxins hos mennesker og husdyr, kan før innhøsting aflatoxin kontroll i mais være den mest effektive måten å hindre aflatoxin forurensning i mat og fôr produkter.
Den store før innhøsting kontroll tilnærmingen for aflatoxin motstand i mais som har vært brukt mye i de siste tiårene er primært gjennom formering, som krever en betydelig mengde tid4. Nylig har biocontrol hatt suksess i aflatoxin reduksjon i stor skala feltet programmer5,6. Foruten biocontrol, har bruken av banebrytende molekylære verktøy som ‘Host indusert Gene Silencing’ (HIGS) gjennom RNAi og transgene uttrykk for motstand-assosiert proteiner hatt suksess i reduksjon av A. flavus vekst og aflatoxin produksjon i liten skala laboratory og felt studier. Disse metodene er optimaliseres i tillegg til å identifisere nye potensielle A. flavus genet mål for fremtidige manipulasjon.
Foruten gener som er direkte involvert i mycotoxin produksjon som potensielle mål av transgene kontroll strategier, har sopp amylases vist seg å spille en avgjørende rolle i å opprettholde vellykket patogenese og mycotoxin produksjon i tidlige fasen verten anlegget infeksjon. Noen eksempler er Pythium pleroticum (kausal agent av ingefær rhizome råte), Fusarium solani (kausal agent av blomkål wilt), der positive sammenhenger mellom virusets og α-amylase uttrykk og aktivitet ble observert 7,8. Hemming av α-amylase aktivitet enten gjennom genet knockout eller pusse tilnærminger påvirker negativt fungal vekst og gift produksjon. En α-amylase knockout mutant av A. flavus klarte ikke å produsere aflatoxins når dyrket på stivelse substrat eller degermed mais kjerner9. Tilsvarende i Fusarium verticillioides mislyktes en α-amylase knockout belastning å produsere fumonisin B1 (mycotoxin) under infeksjon mais kjerner10. En nyere studie viste Gilbert et al. (2018) at en RNAi-baserte slå ned A. flavus α-amylase uttrykk, via HIGS betydelig redusert A. flavus vekst og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon11 .
Bestemt hemmere α-amylase aktivitet har også produsert lignende resultater som hentes fra ned-regulering av α-amylase uttrykk. Den første rapporten om rollen som en α-amylase hemmer i fungal motstand kom fra isolering og karakterisering av en 14-kDa trypsin-α-amylase hemmer fra mais linjer motstandsdyktig mot A. flavus12. Ytterligere screening av flere hundre av plantearter av Fakhoury og Woloshuk førte til identifisering av en 36-kDa α-amylase inhibitor som protein (AILP) fra frø av Jacinto bønner, Lablab purpureus L.13. Peptid sekvensen av AILP lignet lectins Lektiner-arcelin-α-amylase hemmer gultrefamilien rapportert felles bønne14,15. Renset AILP viser ikke noen hemmende aktivitet mot pattedyr trypsin og videre i vitro karakterisering viste betydelig hemming av A. flavus vekst og conidial spiring13. Rapporter presentert her tydelig viser α-amylase kan fungere som et mål i kontroll tilnærminger til begrense patogener eller skadedyr som avhenger av stivelse mobilisering (gjennom α-amylase aktivitet) og oppkjøpet av løselig sukker som energikilde under deres patogene interaksjon med verten planter.
Alpha-amylase er kjent for å være kritisk i A. flavus virusets9,10,11, og betydningen av AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylase hemming/antigrowth)13, Vi generert transgene mais planter uttrykke Lablab AILP gen under konstituerende CaMV 35S arrangøren. Målet var å undersøke om heterologous uttrykk for denne α-amylase hemmer i mais er effektiv mot A. flavus patogenese og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon. Våre resultater viser at transgene mais kjerner uttrykke AILP betydelig redusert A. flavus vekst og aflatoxin produksjon under kjernen infeksjon.
Gi tap i jordbruksprodukter patogener og skadedyr er et globalt problem20. Foreløpig anvendelse av syntetiske soppmidler og plantevernmidler er dominerende kontroll plante-patogener og skadedyr, men gjenværende giftigheten av disse biokjemikalier i mat og feed kan utgjøre alvorlig trussel mot mennesker og dyr helse21. Den økonomiske betydningen av mais mat og fôr beskjære, reduksjon eller eliminasjon av aflatoxin forurensning er av største betydning…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker David Meints, University of Arkansas for hans hjelp i utviklingen og analysere transgene mais under tidlig generasjoner. Dette arbeidet mottok økonomisk støtte av USDA-ARS CRIS prosjektet 6054-42000-025-00D. Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for å gi informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av det oss Department of Agriculture. USDA-ARS’ lik sysselsetting mulighet (EEO) mandater likestilling for alle personer og forbyr diskriminering i alle aspekter av byrået personell politikk, praksis og operasjoner.
Agar | Caisson | ||
Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
Ethanol | |||
FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
Force Air Oven | VWR | ||
FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
liquid Nitrogen | |||
Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
Methanol | |||
Methylene Chloride | |||
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
Potato Dextrose Broth | |||
Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
Stir Plate | |||
Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
V8 juice | Campbell's | ||
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |