Inibizione di crescita di Aspergillus flavus e produzione di aflatossina nel mais transgenici che esprimono la α-amilasi inibitore da Dolichos lablab L.

Contaminazione da micotossine di generi fungini, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria è un grave problema di cibo e mangimi coltivati in tutto il mondo^1,2,3. Tra questi funghi fitopatogeni, Aspergillus ha il più alto impatto negativo sul valore delle colture e salute umana e animale. Aspergillus flavus (A. flavus) è un agente patogeno opportunistico pianta che infetta ricca oleaginose quali mais, semi di cotone e arachidi e produce i potenti cancerogeni, aflatossine, così come numerosi metaboliti secondari tossici (SMs). Mais è un alimento importante e nutrire le colture di tutto il mondo ed è altamente sensibili alla contaminazione da a. flavus. L’impatto economico della contaminazione da aflatossine su perde e valore ridotto in mais può essere tanto quanto $ 686,6 milioni/anno in US² con i previsti cambiamenti nel clima globale, l’impatto delle aflatossine potrebbe comportare perdite economiche maggiore nel mais con stime su quanto $ 1,68 miliardi/anno nel vicino futuro². Dato gli effetti economici e sanitari delle aflatossine negli esseri umani e bestiame, controllo di pre-raccolta aflatossine nel mais potrebbe essere il modo più efficace per prevenire la contaminazione da aflatossine negli alimenti e mangimi.

L’approccio di controllo principale di pre-raccolta per resistenza di aflatossine nel mais che è stato ampiamente utilizzato in questi ultimi decenni è principalmente attraverso l’allevamento, che richiede una notevole quantità di tempo⁴. Recentemente, biocontrol ha avuto certo successo nella riduzione di aflatossina in larga scala campo applicazioni^5,6. Oltre biocontrollo, applicazione di strumenti molecolari all’avanguardia come ‘Host indotto silenziamento genico’ (Villa) attraverso la RNAi e transgenici espressione di proteine associate a resistenza ha avuto un certo successo nella riduzione della crescita di a. flavus e aflatossina produzione in studi di laboratorio e sul campo di piccola scala. Questi approcci sono attualmente in fase di ottimizzazione oltre a individuare nuovi potenziali target di gene a. flavus per modifica futura.

Oltre a geni che sono direttamente coinvolti nella produzione di micotossine come potenziali obiettivi delle strategie di controllo transgenici, amilasi fungine hanno dimostrate di giocare un ruolo critico nel mantenimento della produzione di patogenesi e micotossine successo durante le fasi iniziali di infezione di pianta ospite. Alcuni esempi includono Pythium pleroticum (agente eziologico della putrefazione di zenzero rizoma), Fusarium solani (agente causale della verticillosi cavolfiore), dove le correlazioni positive tra espressione di patogenicità e α-amilasi e attività sono state osservate ^7,8. Inibizione dell’attività α-amilasi tramite knockout del gene o approcci atterramento influenza negativamente la produzione della tossina e di crescita fungina. Un mutante di knockout di α-amilasi di a. flavus è stato in grado di produrre aflatossine quando coltivate su amido substrato o degermed chicchi di mais⁹. Allo stesso modo, in Fusarium verticillioides un ceppo di knockout di α-amilasi non è riuscito a produrre fumonisina B₁ (micotossine) durante l’infezione di chicchi di mais¹⁰. In uno studio più recente, Gilbert et al (2018) hanno dimostrato che una basata su RNAi abbattere di espressione di α-amilasi a. flavus attraverso Villa ridotto significativamente a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l’infezione del kernel mais¹¹ .

Inibitori specifici dell’attività α-amilasi hanno anche prodotto risultati simili come ottenuti da giù-regolamento dell’espressione di α-amilasi. Il primo rapporto sul ruolo di un inibitore di α-amilasi fungina resistenza è venuto dall’isolamento e la caratterizzazione di un inibitore della tripsina-α-amilasi 14-kDa da linee di mais resistente a. flavus¹². Ulteriori controlli di diverse centinaia di specie di piante da fattori e Woloshuk ha portato all’identificazione di una proteina di kDa 36 α-amilasi inibitore-come (AILP) dai semi di fagioli di Giacinto, Dolichos lablab L.¹³. La sequenza del peptide di lectine AILP somigliava appartenente alla famiglia delle lectine – arcelin – α-amilasi inibitore segnalato in comune fagiolo^14,15. AILP purificato non presenta alcuna attività inibitoria nei mammiferi tripsina e ulteriore caratterizzazione in vitro ha mostrato l’inibizione significativa di crescita a. flavus e germinazione conidial¹³. Le relazioni presentate qui chiaramente spettacoli α-amilasi possono servire come una destinazione negli approcci di controllo per limitare gli agenti patogeni o parassiti che dipendono dalla mobilitazione di amido (attraverso attività di α-amilasi) e acquisizione di zuccheri solubili come fonte di energia durante il loro patogeno interazione con piante ospiti.

Alfa-amilasi sono conosciuto per essere critici a. flavus patogenicità^9,10,11e data l’importanza dell’AILP come un potente anti-a. flavus agente (α-amilasi inibizione/antigrowth)¹³, Abbiamo generato piante di mais transgeniche esprimenti Lablab AILP gene sotto il promotore CaMV 35S costitutivo. L’obiettivo era di studiare se l’espressione eterologa di questa α-amilasi inibitore nel mais è efficace contro a. flavus patogenesi e aflatossina produzione durante l’infezione del kernel mais. I nostri risultati dimostrano che chicchi di mais transgenici che esprimono AILP significativamente ridotto a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l’infezione del kernel.