Verhaltens-Tracking und Neuromast Darstellung der mexikanischen Cavefish
Summary
Hier präsentieren wir Methoden für Hochdurchsatz-Studie eine Reihe von mexikanischen Cavefish, Verhaltensweisen und lebenswichtigen Färbung eines Mechanosensory-Systems. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, bietet eine praktische und kostengünstige Methode für das Studium des Verhaltens.
Abstract
Höhlenbewohnenden Tiere haben eine Reihe von morphologischen und verhaltensbezogene Merkmale Anpassung an ihre Umgebung ständig dunkel und Essen spärlich entwickelt. Unter diesen Eigenschaften ist Futtersuche Verhalten eines nützlichen Windows in funktionalen Vorteilen der behavioral Merkmal Evolution. Aktualisierte Methoden für die Analyse von Attraktion Schwingungsverhalten sind hierin dargestellt (VAB: eine adaptive Futtersuche Verhalten) und der damit verbundenen Mechanosensors der Höhle angepasst Tetra imaging Astyanax Mexicanus. Darüber hinaus werden Methoden für Hochdurchsatz-Tracking von einer Reihe von zusätzlichen Cavefish Verhaltensweisen wie Hyperaktivität und Schlafverlust vorgestellt. Cavefish zeigen auch Asozialität, repetitive Verhaltensweisen und höhere Angst. Cavefish dienen daher als Tiermodell für weiterentwickelte Verhaltensweisen. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, die auf andere Arten von Verhalten angewendet werden können. Diese Methoden bieten praktische und kostengünstige Alternativen zu den im Handel erhältlichen Tracking-Software.
Introduction
Die mexikanische Tetra, Astyanax Mexicanus (Teleostei: Characidae), ist einzigartig unter den Fischen mit zwei radikal verschiedene alternative Morphen – sehende, Oberfläche-Wohnung Morph und eine blinde, höhlenbewohnenden Morph, bestehend aus mehreren unterschiedlichen Populationen1. Obwohl verschiedene in der Morphologie und Physiologie, sind sie noch interfertile2,3. Diese interfertile Morphs scheinen schnell (~ 20.000 Jahre)4, wodurch sie ein ideales Modellsystem für das Studium der rasche Anpassung entwickelt haben. Cavefish sind bekannt für eine Reihe von unterschiedlichen morphologischen und Verhaltensstörungen Eigenschaften einschließlich erhöhte Dichte der Geschmacksnerven, erhöhte Anzahl von Mechanosensors, Futtersuche Verhalten auf einer bestimmten Frequenz eines vibrierenden Stimulus, Hyperaktivität, abgestimmt und Schlaflosigkeit. Viele dieser Verhaltensweisen entwickelt, wahrscheinlich gleichzeitig, von denen einige vorgeschlagen wurden, als vorteilhaft in der Dunkelheit von Höhlen für die Nahrungssuche5 und Energiesparen in dunklen und Essen spärlich Umgebungen6,7.
In vielen evolutionären Modellsystemen ist es schwierig, integrierte wissen auf wie tierischer Morphologie und Verhalten ändern in Reaktion auf die Umwelt zu erwerben, da die meisten Arten in einem kontinuierlichen Verlauf in komplexen Umgebungen verteilt sind. Jedoch führte der starke Kontrast zwischen der Höhle und Oberfläche Morph Astyanax , die entwickelt in kontrastreichen Umgebungen abgegrenzt durch eine scharfe Ökoton Astyanax auftauchen als ein hervorragendes Modell zur tierischen Evolution zu verstehen. Dies macht es möglich, leichter Gene und Entwicklungsprozesse mit adaptiven Eigenschaften und Auswahl in der Umgebung zu verbinden. Darüber hinaus neue biomedizinische Untersuchungen dieser Merkmale in Astyanax hat gezeigt, dass diese Züge menschlichen Symptome8,9,10parallele können. Z. B. sind Verlust von Sozialität und Schlaf und Gewinn von Hyperaktivität, repetitive Verhaltensweisen und Cortisolspiegel ähnlich, was bei Menschen mit Autismus Spektrum Störung8beobachtet wird.
Um komplexe Ko-Evolution von vielen Verhaltensweisen und morphologischen Merkmale zu begegnen, ist es vorteilhaft, viele von ihnen zugrunde liegenden genetischen und molekularen Wege markieren assay. Hier werden Methoden zur Charakterisierung des Grades der Höhle-Typ Verhaltens Phänotypen von Oberfläche, Höhle und Hybrid Morphs von Astyanax. Die fokalen Verhaltensweisen analysiert, um Phänotyp zu charakterisieren sind Höhle angepasst Futtersuche Verhalten (Attraktion Schwingungsverhalten, fortan als VAB bezeichnet) und Hyperaktivität/Schlaf Dauer11,12. Auch präsentiert, ist ein bildgebendes Verfahren für das sensorische System VAB13zugeordnet. Vor kurzem, sind viele OpenSource-Tracking-Software für die Ausführung von Verhaltensstörungen Assays zur Verfügung14,15geworden. Diese arbeiten sehr gut für kurze Videos, weniger als 10 Minuten lang. Allerdings wird es problematisch, wenn das Video wegen intensiver Berechnung/Tracking Zeit länger ist. In der Lage, kommerziell verfügbare Software kann teuer werden. Vorgestellten Methoden verwenden hauptsächlich Freeware und daher gelten als kostengünstige und Hochdurchsatz-Methoden. Repräsentative Ergebnisse basieren sich auf diese Methoden ebenfalls enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese vorgestellten Methoden sind leicht zu erreichende aber können kompliziert sein, aufgrund der Beschaffenheit des Landstrichs Freeware durchführen. Daher ist es dringend empfohlen, Test Tests und Analysen vor jeder tatsächlichen Experimente durchführen.
Die Rate der Datengenerierung kann schnell sein, sobald der experimentelle und analytischen Rahmen geschaffen. Einmal etabliert, ist es möglich, aufzeichnen zwei Fische in 7 min zum VAB Test, 30 Fische in 24 h für die Aktivität/Schla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern des Yoshizawa Labor einschließlich N. Cetraro, N. Simon C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato und I. Lord für Fisch Pflege auf die experimentelle Fische in diesem Manuskript verwendet. Wir danken auch A. Keene Lab-Mitglieder, darunter s. Masek Train MY IR CCD Kamera zusammenzubauen. Zu guter Letzt möchten wir der Media Lab – College of Social Sciences – School of Communications an der University of Hawai ‘ i Mānoa für ihre unschätzbare Hilfe mit macht das Video vor allem B. Smith, J. Lam und S. White danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Hawaiian Community Foundation (16CON-78919 und 18CON-90818) und nationale Institute der Gesundheit NIGMS (P20GM125508) vergibt an MY.
Materials
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
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