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Genetics

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

Published: April 11, 2019
doi:
10.3791/59086
, , ,
1Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニア リングする強力な技術です。ここでは、我々 は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々 は、重要な考慮事項と編集の効率を最適化する設計パラメーターを強調表示します。

Abstract

クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) システムは細菌の適応免疫の自然機能が、用途が正常に変更されて多くの異なる生物のゲノム工学のため。最も一般的に、または CRISPR 関連 9 (Cas9) または非相同末端結合 (NHEJ) 経路や相同性監督の修理 (を介して修理する DNA 二本鎖切断後、ゲノムの特定のサイトを切断するために使用 Cas12a エンドヌクレアーゼドナーのテンプレートがあるかによって HDR) 経路は、不在またはそれぞれ現在です。日には、哺乳類細胞でゲノムの編集を実行できるように細菌の異なる種から CRISPR システムを示されています。ただし、技術の見かけのシンプルさにもかかわらず複数の設計パラメーター必要があります考慮する頻繁のゲノム実験を編集を行う最高について当惑のユーザーを残して。ここでは、ゲノムを実験哺乳類セルラインでの編集が正常に実行を容易にする目的で、必要な DNA の変更を運ぶ細胞クローンの同定実験の設計から完全なワークフローを記述します。CRISPR システム、スペーサーの長さ、および単一座礁させた分野 (ssODN) ドナー テンプレートのデザインの選択など、メモを取るユーザーの重要な考慮事項を強調表示します。このワークフローは、遺伝子ノックアウト研究、疾患モデルの作業、役に立つでしょうか、記者の生成細胞を思い描いてください。

Introduction

すべての生きている有機体のゲノムをエンジニア リングすることで、病原の補正など、多くの医学・ バイオ テクノロジー アプリケーションの突然変異、病気の研究、正確な細胞モデルの構築や農業の生成望ましい特徴を持つ作物。世紀の変わり目以来は、哺乳類セルの meganucleases1,2,3を含むゲノム工学の様々 な技術が開発されて、亜鉛指の核酸の4、5、または転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)6,7,8,9。ただし、これらの以前のテクノロジは、プログラムすることは困難または組み立て、退屈な研究と業界での普及を阻害します。

近年では、クラスター化された定期的に空間短い回文繰り返し (CRISPR) – CRISPR 関連 (Cas) システムは、強力な新しいゲノム工学技術10,11として浮上しています。もともと細菌の適応免疫系、それ正常にされている人間を含む動植物のゲノム育種のために展開します。なぜ CRISPR Cas は、このような短い時間でそんなに人気を得ている主な理由 Cas9 や Cas12a (Cpf1 とも呼ばれます) など、キー Cas エンドヌクレアーゼをもたらす要素は、ゲノム内の正しい場所は単にキメラ シングル ガイド RN の短い作品(SgRNA) を設計するは簡単で合成する安価であります。ターゲット サイトに採用されて後、Cas 酵素分子はさみのペアとして機能し、その RuvC、アレイ、または Nuc ドメイン12,13,14バインドされた DNA を切断します。結果として得られる二重鎖休憩 (DSB) 後で非相同末端結合 (NHEJ) または相同監督修理 (HDR) 経路を介して細胞によって修理されています。修理のテンプレートがない場合は、DSB のヌクレオチド (オクターリピート) カットのサイトでの擬似ランダム挿入または削除に上昇を与えることができます、エラーを起こしやすい NHEJ 経路による蛋白質のコーディングの遺伝子のフレーム シフト変異を引き起こす可能性があります修理です。ただし、目的の DNA の変更を含むドナー テンプレートの存在下で、DSB は忠実度の高い HDR 経路によって修復します。ドナー テンプレートの一般的な種類には、一本鎖オリゴヌクレオチド (ssODNs) とプラスミドがあります。前者は、後者は通常使用されますが比較的長いシーケンスを挿入を希望する場合は、目的の DNA の変化が (たとえば、単一の基礎ペアの変化)、小さい場合に使われる (例えば、緑色蛍光蛋白質のコーディング シーケンスまたはGFP) ターゲット遺伝子座に。

Cas タンパク質の酵素活性には、ターゲット サイト15protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の存在が必要です。Cas9 PAM、protospacer の 3′ 端に (Cpf1 とも呼ばれる) Cas12a PAM 5′ 端に代わりに16。Ca ガイド複雑な RNA は PAM17欠席がある場合、DSB を導入することができます。したがって、PAM は、特定の Ca ヌクレアーゼは切断することができるゲノムの位置に制約を配置します。幸いなことに、Cas 細菌種の核酸分解酵素は通常さまざまな PAM 要件を展示します。したがって、様々 な CRISPR Cas システムを当社のエンジニア リングのツールボックスに統合することで、ゲノムの対象にできるサイトの範囲を展開できます。さらに、自然な Ca 酵素を設計またはさらにゲノムのターゲット操作18,,1920にアクセスできる範囲を拡大、PAM のオルタナティブ シーケンスを認識するように進化できます。

複数 CRISPR Cas システムはゲノム エンジニア リング目的で利用できるが、技術のほとんどのユーザーは、複数の理由主に化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 ヌクレアーゼに頼ってきました。まず、比較的単に NGG PAM、複雑 PAMs の存在下でのみ切断することができます他の多くの Ca のタンパク質とは異なりが必要です。第二に、ひと細胞21,22,23,24で展開することに最初の Ca エンドヌクレアーゼです。第三に、SpCas9 は日付に最高の特徴酵素を抜いて。研究者別の Ca ヌクレアーゼを使用する場合、彼または彼女しばしば不明瞭でしょう実験や SpCas9 と比較して異なる生物学的文脈で他の酵素がどのように実行される設計する最善の方法について。

異なる CRISPR Cas システムの相対的なパフォーマンスに明快さを提供するために我々 は最近 5 Ca 酵素-SpCas9、黄色ブドウ球菌(SaCas9)、から Cas9 の酵素 Cas9 酵素の体系的な比較を実行しました。髄膜炎菌(NmCas9)、(AsCas12a)、 Acidaminococcus sp BV3L6 から Cas12a 酵素と菌Lachnospiraceae ND2006 から Cas12a 酵素 (LbCas12a)25。公正な比較のためのターゲット ・ サイトと他の実験条件の同じセットを使用してさまざまな Cas 核酸を評価されます。技術のユーザーのための有用な参照として役立つであろう CRISPR Cas システムごとにも線引き研究設計パラメーター。ここより良い CRISPR Cas の活用研究を有効にするシステム、我々 は別の Cas9 と Cas12a の酵素 (図 1参照) で最適なゲノム工学のステップバイ ステップのプロトコルを提供します。プロトコルにはだけでなく哺乳類細胞で成功したゲノム エンジニア リング結果の可能性を最大限にまた重要な設計上の考慮事項が、実験の詳細が含まれます。

Figure 1
図 1: ゲノムを生成するためのワークフローの概要がひと細胞ラインを編集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

1. sgRNAs の設計 適切な CRISPR Cas システムを選択します。 まず、哺乳類細胞16, 21-32で機能することが示されているすべての Cas9 と Cas12a の核酸分解酵素の PAM シーケンスの対象地域を確認します。5 つの頻繁に使用される酵素は、一緒に彼らのそれぞれの PAMs表 1に与えられています。注: 酵素以外にも哺乳類セル同様、連鎖球菌サーモフィルス(St1Cas9) ?…

Representative Results

ゲノムの実験では、クローンを作成する必要があります興味の軌跡 sgRNA ターゲットを表現する CRISPR プラスミドを編集を実行します。最初に、プラスミッドはそれをリニア化する (通常型酵素) 制限の酵素と消化されます。完全および部分的な消化を区別する未消化プラスミドと一緒に 1% の agarose のゲルの消化の製品を解決することをお勧めします。未消化のプラスミドはスーパー、線形化?…

Discussion

CRISPR Cas システムは、エンジニアのゲノムおよびトランスクリプトームの植物や動物に強力な革新的な技術です。CRISPR Cas システムでは、ゲノム、トランスクリプトーム解析目的44をエンジニア リングの適応が可能性があるを含む多くの菌種が見つかっています。化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 エンドヌクレアーゼが他の細菌由来の酵素細胞21,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. は、科学技術と研究の共同協議会事務所の助成金 (1431AFG103) のための代理店でサポートされて、国立医療研究評議会は、(OFIRG/0017/2016) を付与、国立研究財団補助金 (046-NRF2013-THE001 ・ NRF2013-THE001-093)、教育層 1 の省許可 (RG50/17 (S))、スタートアップは、ナンヤン工科大学、南洋工科大学から国際遺伝子工学機械 (iGEM) 競争のための資金から付与します。

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) NEB M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X 1st Base BUF-3000-50X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X 1st Base BUF-3020-10X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsI NEB R0539
BsmBI NEB R0580
T4 DNA Ligase NEB M0202 400,000 units/ml
Quick Ligation Kit NEB M2200 An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit Thermo Scientific K1423 An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Thermo Scientific 451245 The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli Thermo Scientific C737303
LB Broth (Lennox), powder Sigma Aldrich L3022 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder Sigma Aldrich L2897 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media – – 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Biotechnology A-301
REDiant 2X PCR Mastermix 1st Base BIO-5185
Agarose 1st Base BIO-1000
T7 Endonuclease I NEB M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit Favorgen FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Hyclone SH30081.01 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM Gibco 25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X Gibco 25200
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160 FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X Gibco 20012
jetPRIME transfection reagent Polyplus Transfection 114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 Epicentre LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52067 An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix NEB N0447
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 Merck 539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm Bio-Rad 1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X Bio-Rad 1610772 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X 1st base BUF-2020 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution Sigma Aldrich P7170
TBS, 20X 1st base BUF-3030 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Skim Milk for immunoassay Nacalai Tesque 31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP Advansta K12043
Antibody for β-actin (C4) Santa Cruz Biotechnology sc-47778 Lot number: C0916
MiSeq system Illumina SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
Qubit fluorometer Thermo Scientific Q33226
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Scientific AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA Addgene 61591 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 Addgene 108379 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Addgene 42230 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9 Addgene 41815 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) Addgene 71814 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) Addgene 72247 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
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References

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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).
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