مقايسة الفائق "التنبؤ بالسمية الكيميائية" "الآلي التنميط المظهرية" من ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
وقد وضعت أسلوب كمي لتحديد وتوقع السمية الحادة للمواد الكيميائية من خلال تحليل تلقائياً تحديد سمات المظهرية ايليجانس كاينورهابديتيس. ويصف هذا البروتوكول كيفية علاج الديدان مع المواد الكيميائية في صفيحة 384-جيدا، والتقاط الفيديو، والتحديد الكمي للسمية ذات الصلة تعمل.
Abstract
تطبيق اختبار السمية للمواد الكيميائية في أعلى ترتيب الكائنات، مثل الفئران أو الجرذان، مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، نظراً لعمر طويل ومسائل الصيانة. على العكس من ذلك، وديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) مزايا لجعله خياراً مثاليا لاختبار السمية: عمر قصيرة وزراعة السهل، وكفاءة الإنجاب. هنا، نحن وصف بروتوكول التلقائي التنميط المظهرية من C. ايليجانس في صفيحة 384-جيدا. تربى الديدان السلكية في صفيحة 384-جيدا مع معالجة متوسطة والكيميائية السائلة، وأخذت أشرطة الفيديو لكل بئر التحديد الكمي لتأثير المواد الكيميائية على ميزات دودة 33. وتبين النتائج التجريبية أن ميزات النمط الظاهري كمياً يمكن تصنيف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة أولويات لتقييم السمية الكيميائية التقليدية إجراء مزيد من الاختبارات في نموذج القوارض.
Introduction
جنبا إلى جنب مع التطور السريع للمركبات الكيميائية التي تطبق على الإنتاج الصناعي والحياة اليومية للناس، من المهم دراسة سمية اختبار نماذج للمواد الكيميائية. في كثير من الحالات، يستخدم نموذج الحيوان القوارض لتقييم السمية المحتملة لمختلف المواد الكيميائية على الصحة. بشكل عام، يستخدم تحديد التركيزات المميتة (أي أساييد 50% جرعة مميتة [LD50] للمواد الكيميائية المختلفة) كمعلمة التقليدية في نموذج القوارض (فأر/الماوس) الحية، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب تخفيض، صقل، أو استبدال مبدأ (3R) المركزي للرفق بالحيوان، والأخلاقيات، والأساليب الجديدة التي تسمح لاستبدال الحيوانات أعلى قيمة للبحث العلمي1،،من23 . C. ايليجانس هو ديدان أسطوانية الشرانق التي ظلت معزولة من التربة. قد استخدمت على نطاق واسع ككائن بحث في المختبر بسبب خصائصه المفيدة، مثل عمر قصيرة، وزراعة سهلة وكفاءة الإنجاب. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الممرات البيولوجية الأساسية، بما في ذلك العمليات الفسيولوجية الأساسية واستجابات الإجهاد في C. ايليجانس، هي المحافظة في أعلى الثدييات4،،،من56،7 , 8-يوجد في بضع مقارنات جعلت نحن وآخرون، توافق جيد بين C. ايليجانس السمية والسمية التي لوحظت في القوارض9. كل هذا يجعل C. ايليجانس نموذج جيد لاختبار آثار المجراة في المواد الكيميائية السمية.
في الآونة الأخيرة، بعض الدراسات الكمية السمات المظهرية من C. ايليجانس. يمكن استخدام الميزات لتحليل السمية للمواد الكيميائية2،،من310 وشيخوخة الديدان11. كما وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين دودة سائل استزراع النظام ونظام تحليل صورة، التي تربى الديدان في لوحة 384-البئر تحت علاجات كيميائية مختلفة12. وقد وضعت هذا الأسلوب الكمي لتحليل معلمات 33 C. ايليجانس تلقائياً بعد 12-24 ساعة علاج الكيميائي في صفيحة 384-جيدا مع السائلة المتوسطة. يتم استخدام مرحلة مجهر الآلي لاقتناء الفيديو التجريبية. أشرطة الفيديو يتم معالجتها بواسطة برنامج مصمم خصيصا، وكمياً 33 الميزات المتصلة بالسلوك الديدان المتحركة. الأسلوب يستخدم لقياس تعمل الدودة تحت العلاج 10 مركبات. وتبين النتائج أن السمية مختلفة يمكن أن يغير تعمل من C. ايليجانس. يمكن استخدام هذه الكمية تعمل التعرف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة. والهدف العام لهذا الأسلوب لتسهيل المراقبة والقياس الكمي المظهرية للتجارب مع C. ايليجانس في ثقافة سائل. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتطبيق C. ايليجانس في تقييمات السمية الكيميائية والنمط الظاهري كوانتيفيكيشنز، التي تساعد على التنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة بأولويات لمزيد التقليدية اختبارات تقييم السمية الكيميائية في نموذج القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لسمية الفحص والاختبار لمواد كيميائية جديدة أو المجمع التلوث عامل المضافات الغذائية ومركبات فارماكوتيكال، مجمع خارجية بيئية، وهلم جرا.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا C. ايليجانس أدت إلى أن الاستخدام المتزايد في علم السموم9، سواء بالنسبة للدراسات الميكانيكية والنهج الفرز الفائق. زيادة دور C. ايليجانس في استكمال النظم النموذجية الأخرى في الأبحاث السمية كان ملحوظا في السنوات الأخيرة، خاصة بالنسبة للتقييم السريع سمية المواد ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون يرجى إرسال ايليجانس C. كجك. وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وبرنامج التنمية للصين (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية لمنح الصين (#31401025، #81273108 #81641184) والصحة الرأسمالية للبحث والتنمية للمشاريع الخاصة في بكين (#2011-1013-03)، الصندوق افتتاح مختبر بكين الرئيسية لعلم السموم البيئية (# 2015HJDL03)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة شاندونغ، الصين (ZR2017BF041).
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
