نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق الأفلام ذات البنية النانومترية السليكون المسامية (PSi) كحاملات للتحلل لعامل نمو العصب (ستموت). تتميز تمايز الخلايا العصبية وثمرة PC12 الفئران والخلايا الجذرية الظهرية العقدة (DRG) الخلايا العصبية عند المعاملة مع ناقلات محملة ستحل هذه المبادرة.
وبالرغم من الإمكانات الكبيرة ستموت لعلاج أمراض الأعصاب، وإدارتها العلاجية يمثل تحديا كبيرا كالبروتين لا يعبر حاجز الدم – المخ، نظراً لخواصه الكيميائية، وتتطلب بالتالي طويلة الأجل التسليم إلى الدماغ أثرا بيولوجية. ويصف هذا العمل تصنيع الأفلام هذه المبادرة ذات البنية النانومترية كحاملات القابلة للتحلل من ستموت لإيصال المطرد لهذا البروتين الحساسة. حاملات هذه المبادرة هي مصممة خصيصا للحصول على كفاءة عالية تحميل والإفراج المستمر من ستموت لمدة أربعة أسابيع، مع الحفاظ على نشاطها البيولوجي. سلوك الناقلين PSi ستموت كنظام توصيل ستموت التحقيق في المختبر بفحص قدرتها على حمل تمايز الخلايا العصبية ويعتبر امتداداً للخلايا PC12 وينتابها DRG الخلايا العصبية. يتم تقييم جدوى خلية حضور أنيق وستموت-تحميل ناقلات هذه المبادرة. تتم مقارنة بيواكتيفيتي ستموت صدر من حاملات هذه المبادرة إلى العلاج التقليدي الإدارات ستموت الحرة المتكررة. تحليل تمايز الخلايا PC12 وتتميز بقياس ثلاث معلمات مورفولوجية مختلفة من الخلايا المتمايزة؛ (ط) عدد نيوريتيس استخراج من سوما الطول (ثانيا) نيوريتيس مجموع و (ثالثا) العدد من النقاط المتفرعة. الخلايا PC12 تعامل مع الناقلين ستموت-هذه المبادرة تبرهن تفريق عميق طوال فترة الإفراج. وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا العصبية DRG مثقف مع الناقلين PSi ستموت التكريس نورت واسعة النطاق، معاملة مماثلة للخلايا العصبية مع الإدارات ستموت الحرة المتكررة. إظهار الناقلين الانضباطي درس يزرع طويل الأجل لإطلاق سراح ستموت بإمكانية العلاج لأمراض الأعصاب.
أمر ضروري لتطوير وصيانة الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (PNS)1 ستموت ويلعب دوراً حاسما في بقاء والدالة forebrain القاعدية اتروبين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)2. إمكاناتها الدوائية عالية لعلاج أمراض الأعصاب المركزية، مثل الزهايمر وباركنسون، تم على نطاق واسع أثبت، مع التجارب السريرية حاليا في التقدم3،،من45، 6. التحدي الأكبر في إيصال ستموت للجهاز العصبي المركزي تكمن في قدرته على عبور حاجز الدم في الدماغ (BBB)، عندما تدار النظامية7. وعلاوة على ذلك، ستموت القابلية للتحلل الأنزيمي السريع يجعل نصف العمر القصير، ويحد بشكل كبير بالاستخدام العلاجي8،9. ولذلك، هناك تحد غير ملباة لتصميم نظم التسليم التي تسمح لإطلاق سراح المطولة والتي تسيطر عليها من ستحل بطريقة آمنة. وقد نظم إيصالها ستموت المختلفة، بما في ذلك الأنظمة المستندة إلى البوليمر، درس10،11،،من1213،،من1415، 16 , 17-الإفراج عن ملامح هذه النظم غالباً ما اتسمت باندفاع أولى متميزة يليه بيان مستمر بطيء، حيث كان معدل الإفراج منخفضة إلى حد كبير بالمقارنة مع الاندفاع الأولى11 في المرحلة الأخيرة ،،من1819. وعلاوة على ذلك، لوحظت المنظمة البروتين من منتجات التحلل الحمضي للبوليمرات (مثلاً، حمض poly(lactic-co-glycolic)) أو فقدان بيواكتيفيتي ستموت خلال عملية التغليف مع هذه النظم20.
هذه المبادرة ذات البنية النانومترية ويتسم بخصائص جذابة عدة، بما في ذلك المساحة السطحية العالية وكبر حجم المسامية، توافق مع الحياة، والانحلالية الانضباطي في سوائل الجسم، بريديستينينج ذلك واعدة المخدرات تسليم منصة21، 22،،من2324،25،26،،من2728. الاختيار المناسب لظروفها أنوديزيشن يسمح بسهولة ضبط الخصائص الهيكلية هذه المبادرة (الحجممثلاً، المسامية والمسام) للخياطة تحميل المخدرات وإطلاق سراح حركية21،27. وعلاوة على ذلك، تسمح مختلف الطرق الكيميائية مريحة تعديل سطح هذه المبادرة وذلك اللحن كذلك معدل انحلال سقالة Si الظروف الفسيولوجية ومعدلات إطلاق سراح22،المخدرات24، ،من 2930.
ويركز هذا العمل على تصميم نظام التسليم المستندة إلى هذه المبادرة لإطلاق سراح الخاضعة للرقابة مطول ستموت. أثر الناقلين ستموت-المبادرة في تمايز الخلايا العصبية وثمرة دراسة استخدام الخلايا PC12 وفصل الخلايا العصبية DRG. علينا أن نظهر أن ستموت محملة احتفظت به بيواكتيفيتي بحمل ثمرة نورت والتمايز العميق طوال فترة إصدار 1-الشهر داخل إدارة واحدة.
الأفلام القابلة للتحلل ذات البنية النانومترية بسيو2 ملفقة وتستخدم كناقلات ستموت، مما يسمح للإفراج عنها متواصلة وطويلة، رغم احتفاظها النشاط البيولوجي. أظهر إمكانات بسيو2 لتكون بمثابة نظام التسليم ستموت في المختبر بإثبات قدرتها على إطلاق سراح الجرعة ستموت كافية للحث على تمايز الخلايا العصبية وتعزيز ثمرة DRG الخلايا العصبية وخلايا PC12. يمكن استخدام الأفلام هندسيا كخزانات طويلة الأجل من ستموت للمعالجة المستقبلية في فيفو.
الخصائص الهيكلية للأفلام PSi ملفقة كانت مصممة خصيصا لحمولة ستموت؛ وعدل الكثافة الحالية لعملية النقش الكهروكيميائية للحصول على حجم المسام لما يقرب من 40 نانومتر التي سوف تستوعب بسهولة ستموت، بروتين مع molecular weight من 26.5 كاتشين32 وقطر مميزة من شمال البحر الأبيض المتوسط ~ 433، داخل المصفوفة المليئة بالثغرات. وعلاوة على ذلك، أجرى الأكسدة الحرارية من السقالة المسامية لتمكين امتزاز المادية ستموت حسب الجذب الالكتروستاتيكي البروتين مشحونة بشكل إيجابي على سطح هذه المبادرة المؤكسد مشحونة سلبا. تمارس تأثير كبير على كفاءة تحميل الكيمياء السطحية لهذه المبادرة ويمكن ضبطها بسهولة من أجل تحسين مراقبة التفاعلات بين الحمولة والمصفوفة المليئة بالثغرات. وفي وقت لاحق تملي هذه التفاعلات هيكل الجزيئات البروتينية الممتزة وبهم بيواكتيفيتي34،،من3536. وفي الختام، تم تعديل النظام للحصول على تحميل الأمثل من ستموت بعناية تحديد حجم المسامية الملائمة، والخصائص السطحية والمثل الأعلى تحميل المذيبات والناتجة عن تأثير ما يمليه المعلمات المذكورة تحميل البروتين فعالية. لذلك، أي تغيير في تلفيق المعلمات (مثلاً، كثافة التيار، ووقت النقش، ونوع وتركيز يستعمل أو المنحل بالكهرباء)، الكيمياء السطحية أو تحميل تكوين الحل يمكن أن تؤثر على فعالية التحميل وبيواكتيفيتي من تحميل البروتين.
معدل الإفراج عن حمولة من المضيف2أوربسيو هذه المبادرة عموما تمليها مزيج من اثنين من الآليات المتزامنة، نشر الخارج من جزيئات الحمولة وتدهور سقالة سي37. تآكل ومعدل انحلال اللاحقة تتأثر بغرس الموقع، في علم الأمراض والأمراض الدولة28،38،39. أنشئت في الأعمال السابقة أن إذا كان سعر إصدار مختلفة المطلوبة لتطبيق علاجية معينة، يمكن تعديلها الشخصية الإصدار وأمدها بتغيير الكيمياء السطحية لهذه المبادرة السطحية38،40، 41. التعديلات الكيميائية المختلفة، مثل الأكسدة الحرارية والحرارية الكربنة والتقنيات هيدروسيليليشن، وقد ثبت أن تستقر على سطح هذه المبادرة وتؤثر في تدهور وما يترتب عليها من حمولة الإفراج عن35،42 ،43،،من4445. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يؤدي تحميل ستموت في الناقلات بمرفق التساهمية من جزيئات البروتين إلى سقالة Si عبر مختلف طرق الكيمياء السطحية في بيان مطول أكثر لأن يطلق الحمولة فقط عندما يتم كسر أواصر تساهمية أو دعم الاشتراكية مصفوفة المتدهورة21.
وعلاوة على ذلك، في أعقاب عملية التصنيع فيها، يمكن أن تصبح هذه المبادرة إلى تكوينات مختلفة إلى جانب طبقات رقيقة، مثل المجهرية الدقيقة46،47 من جسيمات نانوية أو الأغشية بذاتها26، التي يمكن أن تستخدم أيضا كشركة نقل جوي ستموت والتطبيق محددة تلبية الاحتياجات.
لكي تكون ذات الصلة سريرياً، ينبغي التوصل إلى محتوى ستموت داخل شركات2 بسيو نطاق الجرعات العلاجية. في الأسلوب الموصوفة في البروتوكول، يتم عرض الناقلين2 تحميل ستموت بسيو متسقة إلى حجم 2 مل من خلية الإعلام أو عدلت تسفر عن المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني، ومن ثم تركز الحل تحميل وكتلة ستموت كل منها محملة وأطلق تركيزات ستموت ذات الصلة للنظام تم اختبارها في المختبر . عند استخدام هذا الأسلوب لأنظمة مختلفة، مثل بيئات فيفو السابقين أو في فيفو ، ينبغي زيادة تركيز ستموت تحميل الحل وتعديلها وفقا للجرعة اللازمة. وبدلاً من ذلك، يمكن الحصول على محتوى ستموت أعلى بإدخال عدة شركات في مجال اختبار أو بواسطة استخدام مساحات أكبر من العينات2 بسيو.
وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن في نقاط زمنية لاحقة على طول فترة الإفراج، تركيزات ستموت المفرج عنهم أقل بكثير من نقاط زمنية سابقة. حقيقة أن تدفق ستموت ليست ثابتة على مر الزمن ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم النظام وفقا لاحتياجات التطبيق.
تسليم ستموت عديدة قد وضعت أنظمة وذكرت في الأدبيات، معظمهم من الأنظمة المستندة إلى البوليمر، تتألف من البوليمر الاصطناعية أو الطبيعية يرتبط10،11،،من1215 , 16 , 17-وقد أظهرت هذه النظم فعالة المطرد الإفراج عن التشكيلات الجانبية، ومع ذلك، الإفراج عن فترة امتدت على مدى فترة عدة أيام مع أثر انفجار كبير. بعض من هذه المنصات تسليم تعاني من القيود الحرجة مثل فقدان بيواكتيفيتي عند عملية التغليف، والتي تتطلب استخدام مختلف استقرار الوكلاء18،48، وكذلك متطورة ومعقدة تقنيات تصنيع16. واحدة من أكبر التحديات في تصميم نظم إيصالها للبروتينات هو القدرة على الحفاظ على بيواكتيفيتي الجزيئات عند فخ داخل منظومة الناقل. يمكن تحميل البروتينات أو الببتيدات في هذه المبادرة/بسيو2 في الرايت أو حتى في درجات الحرارة المنخفضة دون استخدام المذيبات العضوية القوية، التي تعتبر كلا من العوامل الهامة عند تحميل هذه الجزيئات الحيوية الحساسة. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن هذه المبادرة/بسيو2 الكيمياء السطحية يلعب دوراً حاسما في التقليل إلى أدنى حد ممكن تمسخ البروتينات محملة35،36. ولذلك، رطل/بسيو2 نانوماتيريال مفيدة لتطوير نظم إيصالها لعوامل النمو بشكل عام وستموت خاصة.
ويتركز العمل الحالي في استخدام هذا الأسلوب كنهج علاجي جديد للإدارة المباشرة ستموت في الجهاز العصبي المركزي لعلاج محتمل لأمراض الأعصاب. يمكن زرعها الناقلين2 تحميل ستموت بسيو في أدمغة الفئران وفعالية النظام الأساسي كما يزرع طويل الأجل درس في فيفو. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذه شركات واعدة وغير الغازية الهلاميات49،50 قد تمكن واحد لإدارة الجسيمات2 تحميل ستموت بسيو في قرار للغاية مكانية لمنطقة مترجمة باستخدام هوائي رواية الشعرية بندقية لعلاج اضطرابات الأعصاب، حيث يقتضي الأمر وجود إدارة المخدرات الزمانية المكانية. وعلاوة على ذلك، يمكن توجيه ستموت نمو الخلايا العصبية طريقة متدرجة كيميائية51، مماثلة للجزيئات التوجيه إكسون. وهكذا، يمكن تحميل الناقلات2 بسيو بمثابة النقاط الساخنة جاذبة ستموت، لتوجيه نمو، مكملة للأخرى توجيه العظة52،53. وباﻹضافة إلى ذلك، الناقلين2بسيو يمكن أن تكون مصممة خصيصا لإدامة إيصال ستموت لفترة زمنية تمتد كثيرا لتصل إلى عدة أشهر بزيادة ضبط nanostructure2 بسيو وفي الكيمياء السطحية.
The authors have nothing to disclose.
مرض التصلب العصبي المتعدد ووفاق الاعتراف بالخدمات الأساسية ودعم من “مركز لوكي أولاً شاحنة” لعلوم الحياة والهندسة والدعم المالي لمعهد تكنولوجيا النانو بري راسل في معهد التخنيون.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |