キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

1. セルと材料の準備 SorMC バッファーの準備 20.36 g KH2PO4 (15 mM) と 5.47 g ナ2HPO4·7 H2O (2 mM) ddH2O 水 100 mL に溶解して SorMC (ソレンセン MgCl2 CaCl2など) バッファー x 100 の 100 mL を準備します。常温 (RT) ソリューションをかき混ぜるし、dH2o. と 100 mL にボリュームをもたらす注:結果バッファー 6 の pH がありさらに必要はありませんを調整します。 DdH2O. 追加 50 μ L 各 MgCl2および CaCl2各 50 μ M の最終的な濃度を達成するのに作業ソリューション x 1 の 1000 mL を生成します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して、ソリューションを殺菌します。注:常に 100 x 貯蔵液の塩類の析出を避けるため 1 x バッファーに MgCl2および CaCl2を追加します。 また、50 μ M MgCl2を添加した KK2バッファー (KH2PO4 2.2 g と K2HPO4バッファーの 1 L 用の 0.7 g) と 50 μ M CaCl2 (ここ KK2MC と呼ばれる) を準備します。SorMC ではなく全体でこのバッファーを使用します。 D. キイロタマホコリカビの食料源として細菌の準備 健食の単一コロニーを使用し、-LB 培地 (ホストゲノム スープ) の 1 L を接種します。2 L フラスコを使用します。220 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩成長細菌をしましょう。注:大量の細菌が必要な場合は、2xTY のような豊かなメディアを使用して (酵母エキス トリプトン媒体) またはポンドではなくすすり泣き (超最適スープ)。に備えて安全性の制限のためは、健食菌は使用できません、BL21エシェリヒア属大腸菌を代わりに使用することができます。 〜 6,600 × g 20 分洗浄細菌 500 mL の SorMC バッファーに一度で 2 つの 500 mL 遠沈管でスピンダウン: それらによって次の日セルを収穫します。 SorMC 20 mL にペレットを再懸濁します。外径600をチェック (光学密度 600 nm) 光度計を使用して。約 100 の OD600を同じバッファーで希釈します。注:健食菌は、細菌をスピンダウンの比較的高速食品の細菌の損失を避けるために必要があるので、ペレットが困難です。結果細菌原液は冷蔵庫 4 ° C で最大 4 ヶ月間保存でき、 D. キイロタマホコリカビの食料源としてその有用性を維持します。一晩通常 LB 培地で栽培されたk. 水素生成菌懸濁液 1 L には、約 100 の OD600の 20 mL が得られます。注意:準備細菌が健食のモノであることを確認するには、フードの下のすべての手順を実行します。 H40 エレクトロポレーション バッファーの準備 緩衝液 100 mL を準備、ddH2O の水、HEPES の 0.952 g を溶解し、1 M 原液から MgCl2の 100 μ L を追加します。7 の pH を調整する KOH を用いた滴定。0.22 μ m のフィルターまたはオートクレーブを使用してバッファーを滅菌します。酸フリー HEPES とナトリウム塩ではない使用します。 次の製造元のプロトコルと材料表にまとめたキットを使用してプラスミッドの準備を実行します。表 1に要約プラスミドを使用します。注:遺伝子導入用 DNA の品質は重要です。D. 菌の形質転換細胞の細菌の成長の選択に選択と式カセットを運転するプロモーターの特定の要件は、(議論を参照)。 プラスミドの名称 細菌の抵抗/選択 細胞性粘菌で抵抗値/選択 タグ 染色体外発現プラスミド pDM1203 アンピシリン G418 違います pDM1207 アンピシリン G418 N 末端 GFP pDM1208 アンピシリン G418 N 末端 mCherry pPI159 アンピシリン G418 N 末端 mNeon pPI437 アンピシリン G418 N 末端 mScarlet pPI54 アンピシリン G418 N 末端 mTurquoise2 pDM1209 アンピシリン G418 GFP の C 末端 pDM1210 アンピシリン G418 C 末端 mCherry pPI143 アンピシリン G418 C 末端 mNeon pPI459 アンピシリン G418 C 末端 mScarlet pPI142 アンピシリン G418 C 末端 mTurquoise2 シャトル プラスミド pDM344 アンピシリン 違います 違います pDM1019 アンピシリン 違います N 末端 GFP pDM1018 アンピシリン 違います N 末端 mCherry pPI152 アンピシリン 違います N 末端 mNeon pPI418 アンピシリン 違います N 末端 mScarlet pPI150 アンピシリン 違います N 末端 mTurquoise2 pDM1021 アンピシリン 違います GFP の C 末端 pDM1020 アンピシリン 違います C 末端 mCherry pPI153 アンピシリン 違います C 末端 mNeon pPI457 アンピシリン 違います C 末端 mScarlet pPI151 アンピシリン 違います C 末端 mTurquoise2 染色体外発現プラスミド pDM1038 アンピシリン Hygromycin 違います pDM1047 アンピシリン Hygromycin N 末端 GFP pDM1046 アンピシリン Hygromycin N 末端 mCherry pPI450 アンピシリン Hygromycin N 末端 mNeon pPI452 アンピシリン Hygromycin N 末端 mScarlet pPI449 アンピシリン Hygromycin N 末端 mTurquoise2 pDM1049 アンピシリン Hygromycin GFP の C 末端 pDM1048 アンピシリン Hygromycin C 末端 mCherry pPI470 アンピシリン Hygromycin C 末端 mNeon pPI460 アンピシリン Hygromycin C 末端 mScarlet pPI469 アンピシリン Hygromycin C 末端 mTurquoise2 プラスミドをターゲットact5安全な避難所 pDM1501 アンピシリン Hygromycin 違います pDM1513 アンピシリン Hygromycin N 末端 GFP pDM1514 アンピシリン Hygromycin N 末端 mCherry pPI231 アンピシリン Hygromycin N 末端 mNeon pPI419 アンピシリン Hygromycin N 末端 mScarlet pPI228 アンピシリン Hygromycin N 末端 mTurquoise2 pDM1515 アンピシリン Hygromycin GFP の C 末端 pDM1516 アンピシリン Hygromycin C 末端 mCherry pPI230 アンピシリン Hygromycin C 末端 mNeon pPI458 アンピシリン Hygromycin C 末端 mScarlet pPI229 アンピシリン Hygromycin C 末端 mTurquoise2 レミ発現プラスミド pDM1220 アンピシリン Hygromycin 違います pDM1351 アンピシリン Hygromycin N 末端 GFP pDM1259 アンピシリン Hygromycin N 末端 mCherry pPI465 アンピシリン Hygromycin N 末端 mNeon pPI468 アンピシリン Hygromycin N 末端 mScarlet pPI466 アンピシリン Hygromycin N 末端 mTurquoise2 pDM1352 アンピシリン Hygromycin GFP の C 末端 pDM1305 アンピシリン Hygromycin C 末端 mCherry pPI471 アンピシリン Hygromycin C 末端 mNeon pPI467 アンピシリン Hygromycin C 末端 mScarlet pPI472 アンピシリン Hygromycin C 末端 mTurquoise2 フレームのプラスミッドの対象と pDM1355 アンピシリン Hygromycin GFP の C 末端 pPI461 アンピシリン Hygromycin C 末端 mCherry pPI462 アンピシリン Hygromycin C 末端 mNeon pPI464 アンピシリン Hygromycin C 末端 mScarlet pPI463 アンピシリン Hygromycin C 末端 mTurquoise2 ノックアウト プラスミド pDM1079 アンピシリン ブラストサイジン 違います pDM1080 アンピシリン Nourseothricin 違います pDM1081 アンピシリン Hygromycin 違います pDM1082 アンピシリン G418 違います CRE 発現プラスミド pDM1483 アンピシリン Nourseothricin 違います pDM1489 アンピシリン Hygromycin 違います pDM1488 アンピシリン G418 違います 表 1: 非無菌 transfections プラスミド リストです。 トランスフェクションの細胞性粘菌を設定 SM 培地 (栄養分豊富な媒体) で合流する健食を成長した文化で一晩は 4 ° C で最大 2 週間に保存できます。 SM 寒天プレート上にこの細菌懸濁液の約 400 μ L を追加 (ペプトン 10 g/L; 酵母エキス 1 g/L; ブドウ糖 10 g/L;KH2PO4 1.9 g/L;K2HPO4 × 3 H2O、1.3 g/L;MgSO4無水 0.49 g/L;1.7% 寒天) と均等に 。滅菌ループを取るし、細胞性粘菌を接種します。プレートの 1 つの端にあるセルを広めます。 Transfection のための十分に大きい成長ゾーンを確保するため 2 日間の 22 ° C でプレートを孵化させなさい。注:大きな成長ゾーン (例えばAx3、DH1、または JH10) を作成しない、または経験の浅い実験者用細胞性粘菌の菌株の代わりにプレートをクリアします。このため、1.5.4 に 1.5.6 の手順の指示に従います。 滅菌ループを取るし、細胞性粘菌(およそ 2-4 105セル x) で接種します。密度の高い健食の 800 μ L にセルを転送、上下ピペッティングによる SM. ミックス細胞懸濁液。 新鮮な SM 寒天上 400 μ L、200 μ L、100 μ L、50 μ L を転送します。追加 SM ・ k ・水素生成菌懸濁液のすべてのプレート 400 μ L を加える、均等に乾燥します。 プレートは半透明になるまで約 2 日間の 22 ° C でプレートを孵化させなさい。注:その成長速度により当初合流芝生を生産する細菌と、アメーバその後「クリア」細菌のプレート。このプロセスに必要な時間ひずみ背景と細菌に成長する突然変異体の細胞の機能によって異なります。 2. 細菌の選択に基づく細胞性粘菌細胞のトランスフェクション 図 1: 細胞性粘菌の細菌成長の transfection のためワークフロー 。Transfection のための手順は次のとおりです。D. キイロタマホコリカビ細胞を健食菌でシード SM 板 (赤) になります。(ダーク グリーン) をすでに開発している細胞を回避する (緑) の供給の前面からのみセルを収穫します。H40 のセルを洗浄します。2-4 107セル/mL の x の最終密度に細胞を再懸濁します。1-2 μ g の DNA と細胞懸濁液を混ぜます。エレクトロポレーション キュベットとパルス セルに混合物を転送します。エレクトロポレーション後直接セルを SorMC とバクテリアで皿に転送します。5 h の選択可能なマーカーを追加する前に回復する細胞を許可します。染色のプラスミッドのためには、皿に直接選択を追加します。形質転換細胞は ~ 2 日後通常表示されます。ゲノムに単一の統合を目指して一直線に並べられた構成、示される 3 つの希釈を設定し、選択範囲を追加します。細菌は外径600から取られて 100 原液を =。チューブをよく混合し、96 ウェル平底組織培養プレートにセルを転送します。希釈あたり 2 枚の板を使用します。各ウェルに、細胞懸濁液を 150 μ l 添加をピペットします。タイトな植民地が表示されるまで約 5 日かかります。赤の井戸は、正常に変換された細胞 (上部パネル前の文書22から変更) の通常の量の例を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 K. 水素生成菌懸濁液を板を準備するには、10 mL の OD600の密度に健食菌を含む SorMC バッファーを追加 = 2 (準備外径600を 200 μ l 添加目的のため 100 k. 食原液を =細菌濃度) 10 cm に組織培養シャーレを扱われます。注:このプレートは、トランスフェクションの育成に必要な後D. キイロタマホコリカビ細胞。また、6 ウェル培養プレートが使用できます。染色のプラスミドのトランスフェクションの場合 6 ウェル培養プレートは、リソース効率的です。健食SorMC 2 mL を使用して (外径600 = 2) ウェルあたり懸濁液。 細胞性粘菌の準備 10 μ L 使い捨て接種ループを使用して、培養プレート (クリアされた領域の端) またはプレートをオフの成長ゾーン (約 3 cm) から細胞をこすり取る。1 mL の冷たい H40 バッファーを含む 1.5 mL チューブに細胞を転送します。注: プレートをクリアからセルを収穫のタイミングは重要です。後半増加する収穫しながら細胞の量も少し早い収穫を収穫部分的降伏のリスクは、細胞を開発しました。 1,000 x gまたは 2 フラッシュ回転で 2 分間を回してセルを洗浄して 10,000 x gで s。上澄みを廃棄し、2-4 107セル/mL の x の最終密度 H40 バッファー内の細胞を再懸濁します。全体トランスフェクション プロシージャ中にセルの寒さを維持します。直接チューブと氷の氷-水スラリーを使用します。 エレクトロポレーション 1-2 μ g の DNA とチューブに細胞の 100 μ L を追加します。上下にピペッティングして慎重に混ぜます。 中古冷蔵エレクトロポレーション キュベット (2 mm ギャップ) に細胞の DNA の混合物を転送します。 矩形波の次の設定を使用してセルをパルス: 350 V、8 ms、2 パルス、1 s パルス間隔。注:以上 2 μ g の DNA を追加しないでください。高い金額は細胞に有毒、トランスフェクション効率を減らします。DNA 量は 5 μ L を超えないようにしてください。 合計が追加されます。 以前準備 10 cm シャーレ健食SorMC ですぐにセルを転送でき、5 h を回復する細胞。注:倒立顕微鏡下でシャーレ内のセルを確認します。セルはエレクトロポレーション後は直接ラウンドが表示されますが、彼らは表面に接続するための十分な時間があったが、約 30 分後、アメーバの形に戻る。 形質転換細胞の選択: かどうかまたは生成するノックアウト、ノックイン、 act5ノックで、または染色体外プラスミッドから蛍光レポーター蛋白質を表現するため、トランスフェクションが目指している、に応じてのいずれかを選択プロセスを実行方法を次に説明します。注:Axenically 成長の細胞とは異なり、細菌によって成長した細胞、ブラストサイジンに対する優れた耐性。選択、したがって、常に用いて G418 または hygromycin (ディスカッションを参照してください)。 ノックアウト ノック アドイン、 act5 ノック アドイン 繰り返し表面上にピペットから液を強制的にシャーレから慎重に細胞をデタッチします。 SorMC k. 水素生成菌懸濁液の 3 つの希釈を設定 (外径600 = 2) し、抵抗使用される (図 1参照) によると選択のエージェント追加。 低希釈: SorMC の 20.4 mL と健食原液の 600 μ L 細胞懸濁液 9 mL を混ぜます。 培地の希釈: SorMC 28.5 mL と健食原液の 600 μ L 900 μ L の細胞懸濁液をミックスします。 高希釈: 29.3 SorMC mL と健食原液の 600 μ L 細胞懸濁液の 90 μ L をミックスします。 選択可能なマーカー (100 x 貯蔵液) の 30 μ L を追加します。 各ウェルに、細胞懸濁液の 150 μ L 分注で 96 ウェル平底組織培養プレートに準備された希釈を配布します。注:この手順は、画面の単一クローンではなく、集団を目指しています。選択範囲は、使用する構文に応じて、約 5-7 日かかります。 染色体外プラスミド 10 mL の皿に直接選択可能なマーカーを追加 (図 1参照)。注: クローン個体群のための欲求がないので希釈を設定する必要はありません。染色のプラスミッドのための選択プロセスは、高速高コピー数D. キイロタマホコリカビの細胞内に存在する予定です。2 日間に 32 時間後形質転換細胞が期待できます。注意: 選択可能なマーカーとして抗生物質、有害です。手袋を着用します。 肯定的な tranfectants のための得られたクローンをスクリーンします。ノックアウトまたはノックでの試行を 2.5.1 のステップの指示に従います。2.5.2 の手順で指示を使用して染色のプラスミッドのための遺伝子導入成功を確認します。 ノックアウト、ノック アドイン、 act5ノック アドイン、正しいゲノム遺伝子座に、構造の統合を確認する PCR によって最初の画面を実行します。注:クローンの集団の可能性を最大限、最高希釈可能選択後形質転換細胞を生成するを使用します。占められる井戸の最大 1/3 にあるプレートを目指してください。 クローン個体群を展開するには、ゲノム DNA の隔離のための十分な細胞を成長する 12 ウェル培養プレートに 96 ウェル培養プレートからの選択の後で育ってきたクローンを転送します。SorMC健食の 1 mL の各ウェルを供給 (外径600 = 2) と新鮮な選択可能なマーカー。注: 1 日は通常 DNA の隔離のためによく適して合流を得るのに十分です。 ミニ ゲノム DNA の隔離を実行するための合流も細胞を収穫し、製造元の指示に従ってミニ DNA 抽出キットを使用してゲノムの DNA を隔離します。 適切なプライマーとゲノム DNA の分離およびTaqを使用-ポリメラーゼ (材料表参照) 肯定的な積分の PCR 画面に。注:肯定的な統合正しい genomic 位置の確認後、南しみ分析を実行してください。これにより大きな自信を持って不特定のゲノム領域に追加の挿入イベントが発生していないことです。 視覚的に蛍光レポーター蛋白質、蛍光陽性を特定して蛍光顕微鏡でチェックします。また、生化学的同定の適切な抗体で西部のしみを実行します。 PCR プログラム ステップ 温度 時間 初期変性 94 ° C 30 s 30 サイクル 94 ° C 15-30 秒 42 ° C 15-60 s 68 ° C 1 分/kb 最終的な拡張 68 ° C 5 分 ホールド 4-10 ° C 反応成分 コンポーネント 25 μ L 反応 最終濃度 10 μ M 前方プライマー 0.5 Μ L 0.2 Μ M 10 μ M 逆プライマー 0.5 Μ L 0.2 Μ M テンプレート DNA 変数 (ca. 5 μ L) < 1,000 ng ポリメラーゼを含む標準的なバッファーを持つマスター ミックス × 2 (材料の表参照) 12.5 Μ L 1 x ヌクレアーゼ フリー水 25 μ L を < 1,000 ng 表 2: 増幅 PCR プログラムとサンプル組成D. キイロタマホコリカビゲノム DNA 。