Een studie van de Immunohistopathologic profileert de folaat Receptor Beta Macrophage en vasculaire immuun communicatie in gigantische cel Arteritis
Summary
Het protocol illustreert het gebruik van histopathologische onderzoek en immunohistochemistry aan profiel de folaat receptor bèta macrophage en de relatie met de totale immuun cel in de temporele slagader biopsieën in gigantische cel arteritis infiltreren.
Abstract
Reuze cel arteritis (GCA) is een chronische immuun-gemedieerde ziekte van middelgrote tot grote formaat slagaders die oudere volwassenen treft. GCA manifesten met artritis en occlusieve symptomen van hoofdpijn, beroerte of visie van verlies. Macrofagen en lymfocyten van T-helper infiltreren de vasculaire muur en produceren van een pro-inflammatoire respons die leiden tot beschadiging van het schip en ischemie. Tot op heden is er geen GCA biomerker dat ziekte activiteit en gids therapeutische respons kan controleren.
Folaat receptor bèta (FRB) is een glycosylphosphatidylinositol eiwit dat is verankerd op celmembranen en normaal gesproken uitgedrukt in de bloedlijn MyeloMonocytaire en in de meeste myeloïde leukemie cellen zo goed zoals in de tumor en reumatoïde synoviale macrofagen, waar haar expressie correleert met de ernst van de ziekte. Het vermogen van FRB binden folaat verbindingen, foliumzuur-geconjugeerde en antifolate drugs heeft gemaakt een druggable doel in kanker en ontstekingsziekte onderzoek. Dit verslag beschrijft de methoden van het histopathologische en immunohistochemische gebruikt om te evalueren van de expressie en de verspreiding van FRB ten opzichte van GCAimmunopathology.
Formaline-vaste en paraffine-ingebedde temporele slagader Biopten van GCA en normale besturingselementen werden gekleurd met haematoxyline en eosine te herzien Weefsel histologie en Pathognomonisch omgaan. Immunohistochemistry werd gebruikt voor het detecteren van FRB CD68 en CD3 expressie. Een microscopische analyse werd uitgevoerd om te kwantificeren van het aantal positief gekleurde cellen op 10 geselecteerde hoog-power-veldsecties en hun respectieve plaatsen in de arteriële muur.
Lymphohistiocytic (LH) ontsteking gepaard met intima hyperplasie en verstoorde elastische lamina werd gezien in de GCA met geen gevonden in besturingselementen. De LH infiltreren bestond uit ongeveer 60% lymfocyten en 40% macrofagen. FRB expressie was beperkt tot macrofagen, bestaande uit 31% van de totale CD68 + macrofaag bevolking en gelokaliseerd aan de media en de adventitia. Geen FRB werd gezien in besturingselementen.
Dit protocol blijk gegeven van een afzonderlijke numerieke en ruimtelijke patroon van de macrofaag FRB ten opzichte van de vasculaire immuun communicatie in GCA.
Introduction
Reuze cel arteritis (GCA) is een ontstekingsziekte van middelgrote tot grote slagaders, gericht op de aorta en haar bijkantoren en beïnvloeden van oudere volwassenen. Het presenteert met een milde tot ernstige ischemische complicaties, zoals hoofdpijn, kaak pijn, verlies van de visie, beroerte en weefsel gangreen. De diagnose wordt bevestigd door hoge inflammatoire merkers zoals bezinkingssnelheid (ESR) en een aparte histopathologische patroon op de temporele slagader biopsie (tabblad)1. GCA is de meest voorkomende volwassen vasculitis, en de toegankelijkheid van de temporele slagader verkregen voor diagnose presenteert een voordeel ten opzichte van andere vasculopathies, waardoor een te bestuderen zijn pathogenese gemakkelijker. De typische bevindingen op tabblad omvatten een infiltreren van macrofagen/histiocytes en T-lymfocyten aangetroffen in alle vasculaire lagen van de tunica intima, media en adventitia met gelijktijdige vernietiging van de elastische lamina die normaal deze scheidt compartimenten2. Het huidige bewijs toont aan dat de GCA impliceert een onbekende antigeen dat dendritische cellen in de vasculaire adventitia activeert, gevolgd door de indienstneming van helper (Th) T cellen, specifiek Th1 en Th17 subtypen die afscheiden van Interleukine-17 en interferon-gamma (IFG) respectievelijk. IFG dan werft en activeert de macrofagen voor de productie van cytokines en proteasen. Deze omvatten pro-inflammatoire cytokines; met inbegrip van IL-12, die samengebouwd activeert Th1 cellen waardoor een positieve feedback loop; Tumornecrosefactor en Interleukine-6, met als gevolg van artritis en koortsen en metalloproteinasen die schade de elastische lamina. Glucocorticoïden (GC), die de standaard chronische therapie vormen, bepalen gedeeltelijk de cytokine trajecten door verzachtende de Th17/IL-17 maar niet de Th1/IFG-arm van de immuunrespons3,4. Helaas, stopzetting van GC resulteert in ziekte herval. Als een alternatieve modaliteit, methotrexaat heeft geweest voorzien voor GCA behandeling, maar de gewenste klinische eindpunten waren niet consequent bereikt hoewel gevoeliger biomarkers niet voor therapeutische toezicht5,6 gebruikt hebben . In 2017, werd de Interleukine 6 blocker, tocilizumab, goedgekeurd voor de behandeling van de GCA zoals effectief blijkt ziektebestrijding en steroïde sparend effecten7,8.
Tot op heden zijn er geen goede biomarkers voor GCA. Dientengevolge, kan het moeilijk zijn om te controleren van de activiteit van de ziekte en titreer doses van beschikbare drugs voorkoming van negatieve effecten te verminderen van de last van de kosten voor de samenleving. Het is dus absoluut noodzakelijk om te zoeken naar een biomarker van de kandidaat-lidstaten dat correlaten met ziekte-activiteit, nieuwe inzichten over de pathogenese en therapeutische besluiten steun verstrekken.
De disregulatie van macrofaag activering is een cruciale factor in de pathogenese van de GCA. Dus, een effectieve middelen voor de behandeling van de GCA kan worden de selectieve doelgerichtheid van geactiveerde macrofagen. De folaat receptor beta (FRB) is een glycosyl-phosphatidylinositol glycoproteïne die is verankerd op de celmembraan uitgedrukt in normale MyeloMonocytaire cellen, myeloïde leukemie cellen en macrofagen geactiveerd. De ligand, foliumzuur, is een essentieel vitamine in zijn gereduceerde vorm, waarmee cellulaire DNA synthese, methylation en reparatie9. FRB expressie wordt in auto-immune ziekte en tijdens carcinogenese geïnduceerd. Haar expressie is beperkt tot het oppervlak van de monocyten of pro-inflammatoire M1 macrofagen bij reumatoïde artritis, of anti-inflammatoire M2 macrofagen in solide orgel en myeloïde maligniteiten10,11,12 , 13. Naast zijn potentiële rol als een biomarker van geactiveerde macrofagen, de FRB selectieve drug vervoer door middel van een multi stap proces dat met de receptor binden aan foliumzuur, antifolates of folaat-geconjugeerde drugs bij de cel begint kunt inschakelen oppervlakte, gevolgd door internalisering, de introductie en de uiteindelijke levering van gewenste drug aan de interne cel machines12,14,15,16. In tegenstelling tot FRB uitgedrukt in kankercellen en macrofagen geactiveerd, uitgedrukt in normale hematopoietische cellen FRB is niet in staat om te folates, waardoor ervoor wordt gezorgd dat FRB/folaat-gemedieerde drug delivery beperkt tot FRB-positieve inflammatoire of kankercellen is binden.
In onze eerdere studie, we laten zien voor de eerste keer dat FRB wordt uitgedrukt in GCA macrofagen en haar expressie gecorreleerd met CD68 + en endothelin receptor bèta macrofagen, die tot de GCA pathogenese17 bijdragen. In dit verslag, beschrijven we de histopathologische immunohistochemische methoden gebruikt voor het beoordelen van de FRB macrophage en de totale lymfocyt geanalyseerd en macrofaag telt om inzicht in de de FRB positie in het GCA vasculaire landschap.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA is de meest voorkomende vasculitis bij volwassenen, en haar pathologische hallmark is een voorbeeld van een krachtige combinatie van T-helper-lymfocyten en macrofagen die kunnen ook worden gevonden in andere granulomateuze ziekten of vasculopathies zoals sarcoïdose geactiveerd en Granulomatous polyangiitis2,3. GCA, de temporele slagader biedt een goede vertegenwoordiging van een middelgrote tot grote formaat slagader en de TA biopsie geeft een omvangrijke st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de steun van Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, de divisie voor Reumatologie/Vakgroep Geneeskunde en moleculaire en histopathologische Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. . Primer on the rheumatic diseases. , (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis – a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. . Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. . Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A., Fratzl, P. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
