Murine ब्राउन वसा ऊतक के क्रोमेटिन Immunoprecipitation
Summary
यहाँ हम कुशल क्रोमेटिन immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (चिप) ब्राउन वसा ऊतक के उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण (चिप-seq) द्वारा पीछा किया (बैट) एक माउस से पृथक. इस प्रोटोकॉल दोनों मानचित्रण हिस्टोन संशोधनों और vivo मेंब्याज की गैर हिस्टोन प्रोटीन के जीनोम व्यापक स्थानीयकरण की जांच के लिए उपयुक्त है ।
Abstract
सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं विशिष्ट जीन कार्यक्रमों के transcriptional मॉडुलन द्वारा विनियमित रहे हैं । इस तरह मॉडुलन प्रतिलेखन कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला के संयुक्त कार्यों के माध्यम से हासिल की है (TFs) और cofactors मध्यस्थता transcriptional सक्रियण या दमन क्रोमेटिन संरचना में परिवर्तन के माध्यम से. क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक उपयोगी हिस्टोन संशोधनों मानचित्रण और प्रतिलेखन कारकों/cofactors डीएनए के लिए बाध्यकारी, इस प्रकार गतिशील परमाणु विभिंन के दौरान होने वाले परिवर्तन का एक स्नैपशॉट प्रदान करने के लिए आणविक जीवविज्ञान दृष्टिकोण है जैविक प्रक्रियाओं ।
वसा ऊतक, में से व्युत्पंन नमूनों में transcriptional विनियमन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो सेल संस्कृतियों का अमरता या प्राथमिक सेल लाइनों अक्सर क्योंकि सामग्री शुरू करने और कम जैविक परिवर्तनशीलता की बहुतायत की चिप परख में इष्ट हैं । हालांकि, इन मॉडलों के रहने वाले जीवों में वास्तविक क्रोमेटिन राज्य के एक सीमित स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस प्रकार, वहां अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण की जरूरत है वसा ऊतक पशु मॉडलों से व्युत्पंन नमूनों पर चिप प्रदर्शन ।
यहां हम हिस्टोन संशोधनों और भूरे वसा ऊतक (चमगादड़) एक माउस से अलग में गैर हिस्टोन प्रोटीन के कुशल चिप-seq के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रोटोकॉल एक आकृति विज्ञान और वसा डिपो के बीच शारीरिक रूप से अलग ऊतक है जो बल्ले में ब्याज और epigenetic मार्करों के प्रोटीन के जीनोम व्यापक स्थानीयकरण की जांच के लिए अनुकूलित है ।
Introduction
जबकि सफेद वसा ऊतक (वाट) ऊर्जा भंडारण के लिए विशेष है, ब्राउन वसा ऊतक (बैट) गर्मी के रूप में ऊर्जा के अपव्यय को तापीय ऊर्जा में कार्बोहाइड्रेट और लिपिड mitochondrial uncouplन1 के माध्यम से परिवर्तित करने की क्षमता के कारण । इस विशेष समारोह के कारण, चमगादड़ डिपो शारीरिक स्थितियों में शरीर के तापमान के रखरखाव के लिए और ठंड जोखिम के जवाब में आवश्यक है । जबकि जीन भेदभाव के दौरान अभिव्यक्ति परिवर्तन और thermogenic तनाव पर बड़े पैमाने पर vivo में अध्ययन किया गया है और इन विट्रो में, इन परिवर्तनों अंतर्निहित आणविक तंत्र ज्यादातर अमर कोशिका लाइनों और प्राथमिक में विच्छेदित किया गया है पूर्व adipocytes, vivo अध्ययन में कई के अपवाद के साथ2,3,4,5.
transcriptional विनियमन के माध्यम से विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के विनियमन विभिन्न प्रतिलेखन कारकों और सह कारकों क्रियाओं के माध्यम से क्रोमेटिन संरचना में समंवित परिवर्तन द्वारा हासिल की है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) डीएनए के लिए इन कारकों की भर्ती की जांच करने के लिए और क्रोमेटिन परिदृश्य में जुड़े परिवर्तनों की रूपरेखा के लिए एक मूल्यवान आणविक जीवविज्ञान दृष्टिकोण है । चिप प्रयोगों की सफलता के लिए मुख्य कारक crosslinking स्थितियों और विभिन्न नमूनों भर में क्रोमेटिन बाल काटना निरंतरता का अनुकूलन, पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री की उपलब्धता, और, सबसे विशेष रूप से, एंटीबॉडी की गुणवत्ता शामिल हैं. जब पूरे ऊतकों से चिप प्रदर्शन कर, यह भी नमूनों की विविधता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है और नाभिक अलगाव की दक्षता में सुधार करने के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन, बाद एक विशेष रूप से संवेदनशील कदम जा रहा है जब वसा के कारण ऊतक के साथ काम करने के साथ ऊंचा लिपिड सामग्री । वास्तव में, पूरे वसा डिपो से आणविक अलगाव की तकनीक ट्राइग्लिसराइड्स के उच्च स्तर की उपस्थिति से जटिल हैं, और प्रोटोकॉल क्रोमेटिन अलगाव की मात्रा में वृद्धि करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. अंत में, जब उच्च-प्रवाह अनुक्रमण चिप-डीएनए अलगाव के बाद किया जाता है, sequencing गहराई आत्मविश्वास से पता लगाया है कि चोटियों की संख्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यहां, हम काम कर रहे मानकों और चिप के लिए सामांय दिशा निर्देशों का उल्लेख seq प्रयोग सांकेतिक शब्दों में बदलना और modENCODE consortia6 द्वारा अनुशंसित सर्वोत्तम प्रथाओं के लिए, और हम एक कदम पर ध्यान केंद्रित एक चिप-बल्ले से seq के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल के कदम का विवरण । वर्णित प्रोटोकॉल वसा ऊतक से क्रोमेटिन के कुशल अलगाव के लिए अनुमति देता है के साथ डीएनए बाध्यकारी कारकों के लिए जीनोम व्यापक अनुक्रमण प्रदर्शन अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों के साथ ही अधिक फैलाना संकेतों के साथ हिस्टोन निशान ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित murine ऊतकों से चिप प्रदर्शन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से भूरे रंग के वसा ऊतक के लिए अनुकूलित । ऊतक से चिप प्रदर्शन में अधिक से अधिक चुनौतियों में स…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
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