الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب
Summary
سنوبس هي الاصطناعية العقاقير غير الترميز الكشف، التي تحتوي على مجال ملزمة (دينار بحريني) ومجال المستجيب (اد) ومتابعة تنظيم الترجمة من استهداف مرناً. هنا، نحن تصف أساليب الكشف سنوبس في خطوط الخلايا المستزرعة، تحليل لنشاطهم تشجيع الترجمة بوصمة عار الغربية وإنتاجية عالية شبه الآلي نظام التصوير.
Abstract
بروتين يستهدف تعزيز أهمية ليس فقط لدراسة العمليات البيولوجية وإنما أيضا لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والعلاجية. وهنا، نقدم أسلوباً انتقائيا حتى-تنظيم التعبير البروتين المطلوب الجينات في الخلايا المستزرعة عن طريق antisense الاصطناعية غير الترميز الكشف المعروفة باسم سينيوبس. عنصر التحكم هذا إيجابيا للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال وتمارسها مقلوب قصيرة اينتيرسبيرسيد النووي عنصرا (شرط) كرر في نهاية 3ʹ سينيوبس التي تضم المجال المستجيب (ED). يمكن ربط سنوبس على وجه التحديد أي مرناً ترميز البروتين من الاختيار من خلال المجال ملزم به (دينار بحريني)، منطقة مصممة لتكملة التسلسل داخل المنطقة غير مترجمة 5ʹ (5ʹ UTR) وما حولها كودون بداية من مرناً. سنوبس محددة الهدف المصممة بهذه الطريقة هي transfected الخلايا المستزرعة، ويتم استخراج البروتين والحمض النووي الريبي المصب التحليلات، عموما تعداء بعد ح 24-48. الكشف عن البروتينات المستحثة سينوب أعلى-التنظيم بواسطة تحليل وصمة عار الغربية والتعبير الحمض النووي الريبي يقاس باستخدام النسخ في الوقت الحقيقي عكس الكمي PCR. وقد لاحظنا أن تصميم دينار بحريني أمر حاسم لتحقيق أمثل سينوب النشاط وأن اختبار مختلفة الأحجام دينار بحريني والمواقف فيما يخص كودون ابدأ الهدف مرناً ويوصي. ولذلك نحن هنا وصف أسلوب تصوير الفائق شبه إليه يقوم على الكشف عن الأسفار التي يمكن تنفيذها للهدف مرناً تنصهر مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). سنوبس على وجه التحديد تعزيز الترجمة ضمن مجموعة الفسيولوجية العادية للخلية، دون تغيير مستوى نص الهدف. وقد استخدمت هذا الأسلوب بنجاح ضد مجموعة من الأهداف الداخلية والخارجية، في مجموعة متنوعة واسعة من البشرية، والماوس، وخطوط الخلية الحشرات جنبا إلى جنب مع نظم المجراة. وعلاوة على ذلك، أبلغ سنوبس على زيادة إنتاج الأجسام المضادة والعمل كالحمض النووي الريبي علاجية ضد الجينات هابلوينسوفيسينت. طبيعة تنوعاً ووحدات سنوبس يجعل منها أداة مناسبة لمراقبة المتعدية الجينات على حدة.
Introduction
في حقبة ما بعد الجينوم، اكتسبت العديد من الأفكار إلى أدوار تنظيمية الجينات غير ترميز النصوص العقاقير نظراً لتطوير الجيل التالي تسلسل التكنولوجيات1،،من23 و أدوات تحرير الجينات. هذه الفئة من النصوص، التي كانت تعتبر سابقا أن يكون “سلة المهملات النسخي”، ثبت الآن كلاعب رئيسي من المادة الوراثية. محاضر العقاقير أفيد بأن تعدل الكروماتين والاستقرار التحكم والتعبير عن تلك المشابهة ترميز البروتين معنى مرناً4،5. في معظم الحالات، هذا النمط من التنظيم سلبي والمستنسخات العقاقير إسكات نظرائهم الإحساس عن طريق الحمض النووي الريبي الريبي التفاعلات6،7. هذه سمة النصوص العقاقير الطبيعية قد استخدمت للجينات دوونريجولاتي المطلوب في شكل الاصطناعية الصغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، ميكرورنا (ميرنا)، والعقاقير أوليجوس (أسو)8،9،10 ،11 ترك فراغاً تكنولوجية لاستهداف أعلى-تنظيم الجينات.
دراسة مثيرة للاهتمام واحد تغيير منظور مجال الحمض النووي الريبي العقاقير بإثبات أن antisense طويلة غير الترميز الكشف (مثل لنكرناس) من الجينات Uchl1 (هيدرولاز ubiquitin الطرفية ج L1) أوكست (أوبيكويتوسلي-أعرب عن نسخة) تنظيم إيجابي ترجمة بهم قرابة بمعنى مرناً على مستوى بوستترانسكريبشونال في الفئران12. نهاية 5ʹ من هذه لنكرناس يتداخل مع عدة قواعد في المنطقة غير مترجمة 5ʹ (5ʹ UTR) هذه النصوص معنى المقابلة، ويحتوي على نهاية 3ʹ غير متداخلة تكرار مقلوب ريتروترانسبوسون المنتمين إلى القصير ويتخلل النووية الأسرة عنصر (شرط). من المثير للاهتمام، وجدنا أن القوة الدافعة الرئيسية وراء هذا التنظيم يصل متعدية كرر جيب جزءا لا يتجزأ، وأنه لا يقتصر على الماوس جيب يكرر فقط. الإنسان الو تكرار المحتوية على لنكرناس أيضا تعزيز ترجمة مرناس الإحساس بالهدف، يعزز فكرة فئة جديدة من antisense التنظيمية يحركها شرط الكشف، غير الترميز المسمى سنوبس13. وأظهرت الدراسات الأخيرة أن إمكانات طبيعية سينيوبس يتم الاحتفاظ بها في سينيوبس الاصطناعية يستهدف على وجه التحديد الهدف الجينات داخلية وخارجية مختلفة14،15. سينيوبس أن اثنين من السمات الهامة: الأولى “المجال ملزمة” (دينار بحريني) عموما وهي منطقة نهاية 5ʹ مكملة للتسلسل الذي يشمل المرحلة الابتدائية تبدأ كودون مرناً ترميز البروتين، والثانية “المجال المستجيب” (ED) كما أنه يشتمل مقلوب تكرار للشرط الذي شرط مسبق ل الدالة سينوب14 (الشكل 1). يمكن تخصيص سنوبس لتصميم دينار بحريني على وجه التحديد استهداف جين للاختيار. ثم هذا يمكن تسخيرها لتشريح وظيفة الجينات خاصة تشارك في مسار بيولوجية، كبديل أفضل لاستراتيجية overexpression مرناً تقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الأداة تنوعاً لزيادة إنتاج الأجسام المضادة، و كدواء لعلاج الأمراض هابلوينسوفيسينت التي تسببها جرعات غير كافية من البروتينات الوظيفية16،،من1718، 19،،من2021.
وتتعدد مزايا التكنولوجيا سينوب. فإنه لا يغير من التعبير عن الهدف على المستوى النسخي. أطول خدمات تنمية الأعمال التجارية توفر المزيد من الخصوصية سنوبس، بينما لا يحفز استجابة إجهاد دسرنا-تعتمد على15. يتم الحفاظ على استحثاث البروتين داخل مجموعة الفسيولوجية العادية للخلية، والحيلولة دون أي تأثير ضار بسبب التعبير البروتين شاذة أو مفرطة. سينيوبس متوافقة مع مجموعة متنوعة واسعة من الماوس، والبشرية، ومثقف الهامستر خطوط الخلايا، على سبيل المثال، HEK293T/17، HepG2، هيلا، شو، MN9D، والعديد من أكثر12،13،،من1415،18 ،19. يمكنك استهداف سنوبس الكفاءة الذاتية الجينات والجينات overexpressed عابر ومعلم العلم أو لوسيفراس-الانصهار الجينات، مما يلغي الحاجة للأجسام المضادة الخاصة بالجينات14،18. تحليل سينيوب الأساسية يتطلب ثقافة الخلية الروتينية وتعداء والصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، الوقت الحقيقي النسخ العكسي الكمية-بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرت-PCR) الصكوك والإعدادات، و يمكن اكتساب الخبرة في فترة زمنية قصيرة.
وهنا يصف لنا أسلوباً لاستهداف الجينات مع سنوبس الاصطناعية لمتابعة تنظيم الترجمة، تأثير خلافا لغيرها من التكنولوجيات مثل الحمض النووي الريبي التدخل9 واسو جابميرس11،،من2223. أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتنشيط الجينات الموجهة بالجيش الملكي النيبالي هو متفاوت المسافات بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب المستندة إلى تكرار التنشيط (كريسبرا)، حيث يتم تشغيل تعبير الجينات في المستوى النسخي24. يتطلب هذا الأسلوب، بسيطة وسريعة، على الرغم من عدة دليل واحد الكشف (سجرناس) استهداف الجين نفسه لكفاءة أعلى، مما يزيد من فرص ربط خارج الهدف25. وبالإضافة إلى ذلك، قد الإنزيم الرئيسية للنظام كريسبرا، البروتين حفازة الميت المرتبطة كريسبر 9 (dCas9) خصوصية ملزمة منخفضة واستهداف سجرناس مناطق المروج ثنائي الاتجاه يمكن غير-متابعة-تنظم تحديداً القريبة الجينات25. على العكس من ذلك، سينيوبس ربط لاستهداف مرناً في منطقة ملزم واحد مع خصوصية عالية، ولا تؤثر على الجينات القريبة. ونحن نناقش الخطوات الأساسية المتبعة في تصميم سينوب تعداء والبروتين والحمض النووي الريبي تعبير تحاليل. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم شبه الآلي، الفائق تصوير نظام الشاشة سنوبس متعددة في وقت واحد، ومفيد للكشف عن سنوبس الأمثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت لنا هنا بروتوكولا لتعزيز إنتاج البروتين على وجه التحديد الهدف مرناً عن طريق المحتوية على شرط غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، يسمى سنوبس. وكمثال ممثل، يرد سينيوب الاصطناعية الأمثل-بروتينات فلورية خضراء لمتابعة تنظيم ترجمة مرناً بروتينات فلورية خضراء 2.6-fold كما تقاس بتحليل وصمة عار الغربية.
تصميم دينار بحريني أمثل أمر حاسم لضمان خصوصية سينوب وفاعلية (مدى يصل البروتين-التنظيم). سابقا، ونحن فحص 17 خدمات تنمية الأعمال التجارية من سينوب-التجارة والنقل بالغربية-لطخة تحليل15 ووجد أن دينار بحريني الأمثل يتراكب تسلسل أغسطس-كوزاك مرناً بروتينات فلورية خضراء، على الرغم من أنه قد لا يكون الحال بالنسبة لسائر مرناس وينبغي التحقق من كل حالة. أيضا فحص مجموعة مستقلة أخرى تستخدم طريقة مختلفة31دينار بحريني. كما فحص العديد من خدمات تنمية الأعمال التجارية يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً ومرهقة، قدمنا طريقة كشف سينوب الفائق هنا. هذا الأسلوب يقيس التغيرات النسبية في كثافة التجارة والنقل المتكامل في سينوب transfected-الخلايا مقارنة بمكافحة ناقلات الأمراض transfected-الخلايا. لضمان أن يتم transfected الخلايا في بئر معينة للوحة الثقافة على قدم المساواة وبروتينات فلورية خضراء إشارة لا تتركز على منطقة معينة من البئر، من المهم جداً لتوزيع الخلايا على قدم المساواة في الآبار في الخطوة 2، 1. لهذا الغرض، بلطف يهز لوحة 10 مرات ذهابا وإيابا (↑↓) بعد زرع الخلايا داخل هيئة نظيفة وكرر في الحاضنة2 CO 5% قبل البدء في الحضانة.
خطوة حاسمة أخرى يتم حساب تركيز البروتين في الخطوة 3، 3. الحسابات الخاطئة هنا يمكن أن يؤدي إلى تحميل مبلغ الخاطئة للبروتين أثناء تحليل وصمة عار الغربية، وبالتالي منع الكشف عن التغيرات الصغيرة في التعبير البروتين ببعض سنوبس ضعيفة أو توليد المغلوطة من الحمولة الزائدة. من المستحسن طازجة إعداد المنحنى المعياري البروتين كل مرة، والتأكد من أن يتم قياس كميات متساوية من المعايير وعينات البروتين في خطوة 3.3.3. البروتوكول الموصوفة هنا يركز على سينيوب-التجارة والنقل، ولكن يمكن استخدام التحليل الغربية-وصمة عار لأي استهداف مرناً للفائدة. ينبغي أن يكون الأمثل في وقت الحضانة وتركيز الأجسام المضادة لكل هدف للحصول على أفضل نتيجة لذلك.
واحدة من السمات الفريدة سنوبس أن مستوى التعبير الهدف مرناً وتظل غير متأثرة. من المهم التعامل مع الجيش الملكي النيبالي مع الدناز لتجنب الكشف عن سنوبس ترانسفيكتيد والحمض النووي بواسطة qRT-بكر. الكشف سينيوب والتعبير مرناً الهدف ينبغي أن تقاس قرت-PCR لتأكيد نجاح تعداء والنشاط سينيوب. سنوبس تحتوي على تسلسل جيب، ووفيرة في جميع أنحاء البشرية وجينوم الفأر. لتجنب الكشف غير محددة شرط متواليات، لا ينصح لتصميم كبسولة تفجير qRT-بكر لتسلسل جيب.
في هذا البروتوكول استخدمنا خطوط الخلايا البشرية، ولكن سنوبس الناجعة في عدد من خطوط الخلايا من عدة أنواع مختلفة12،13،14،،من1819. يمكن تعديل شروط الثقافة وتعداء الخلايا وفقا لخطوط الخلايا المختلفة ما دامت هذه المحافظة على كفاءة تعداء موجهات سينوب. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام أساليب بديلة لاستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، والتحقق من تركيز البروتين، نظراً إلى أن تحافظ على نوعية البروتين والحمض النووي الريبي مطلوب بكر قرة وتحليل وصمة عار الغربية. بينما كنا محددة في سيتوميتير الصغرى، حسنا الفائق، الذي مكن كشف الأسفار التجارة والنقل عبر البئر كامل، سيتوميتيرس الأخرى بالكشف عن مجموعة مماثلة يمكن أن تستخدم31. جدير بأن إذا كان توزيع الخلايا وتعداء متساوون في جميع أنحاء بئر، ثم أنه من غير الضروري تفحص البئر كله للأسفار التجارة والنقل: نصف أو ربع من منطقة بئر قد تكون كافية لتمييز تأثير سينوب اعتماداً على التجربة نادي المهارات.
وضع بروتوكول اكتشاف سينوب الفائق يسمح للفحص المتزامن من خدمات متعددة تستهدف مرناً معين في الخلايا المستزرعة. هذا أمر هام نظراً للقواعد المنظمة لاستهداف الأمثل بدينار بحريني لا يزال غير واضح. هذه متعدد فحص نظام يسمح لاختبار على نطاق واسع من سنوبس كثيرة ضد جينات مختلفة، مفيدة لاستهداف جينات متعددة تشترك في مسار إشارات معينة على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لتوسيع نطاق البحث عن سنوبس فعالة تستهدف مرناس عدة، تصميم “خدمات سينوب” مختلفة حول المنطقة أغسطس-كوزاك (انظر الشكل 1)، شارك ترانسفيكتينج كامل طول الهدف مرناس (UTR UTR-الأقراص المدمجة-3ʹ 5ʹ) تنصهر مع مرناً بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المستزرعة للعثور على سنوبس الأمثل، وبعد ذلك اختبار المرشحين دينار بحريني ضد مرناً الذاتية في الخلايا المستزرعة والحيوانات الحية في نموذج، من البشر والفئران إلى غيرها من الأنواع الحيوانية والنباتية.
هذا البروتوكول الفحص بسرعة جداً. نحن لسنا في حاجة إلى إصلاح، وجمع الخلايا، ولكن فقط بحاجة إلى مكان المعيشة الخلية لوحة الثقافة في الصك التصوير. نقترح أن تستخدم هذا البروتوكول الفرز الفائق لتحديد “خدمات تنمية الأعمال التجارية سنوبس” الأمثل، وتقييم المرشحين المحتملين عن طريق تحليل وصمة عار الغربية. وهكذا، يمكن تطبيقها المرشحين المختارين مع الأمثل خدمات تنمية الأعمال التجارية لزيادة جسم إنتاج18،،من1921. حاليا، يتزايد جذريا الميدان العلاجي الجيش الملكي النيبالي. على سبيل المثال، siRNA واسو ومرناً، والعلاجات “كريسبر الجيش الملكي النيبالي”، وتستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير مرناً أهداف كل منها9،32. وفي هذا السياق، سينيوبس في مراحلها الأولى، ولكن حتى الآن أيا من سينيوبس درس تغيير التعبير عن مرناس المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، لا تحرير سينيوبس استهداف مرناً، ولكن فقط حتى تنظيم ترجمة مرناً. وعلاوة على ذلك، يمكن استهداف خسارة للدالة الأمراض الناتجة عن هابلوينسوفيسينسي بالعلاج سينوب، تحقيق إضعاف التعريفي17،نقص البروتين33. على الرغم من أن الآثار خارج الهدف تحتاج إلى مزيد من الدراسة، سينيوبس المحتملة، وعلى وجه التحديد استهداف مرناً واحد، أعرب مع تسلسل مكملة لدينار بحريني.
حد لهذا البروتوكول الفائق أنها ليست مناسبة “خدمات تنمية الأعمال التجارية سنوبس” الشاشة في الماوس المجراة في نماذج لتدابير البروتوكول التجارة والنقل المتكاملة لكثافة فقط. كما سنوبس لنكرناس العقاقير الطبيعية التي تعمل بوستترانسكريبتيونالي، لا يمكن تطبيقها عند الهدف مرناً مفقود في الخلايا أو عينات الأنسجة.
ومع ذلك، يمكن تطبيق سنوبس لدراسات مكسب للدالة، لتعزيز إنتاج الأجسام المضادة، و كعلاج الحمض النووي الريبي لمتابعة تنظيم التعبير عن نقص البروتينات داخل نطاق 1.5-3.0-إضعاف. الأساليب الموصوفة هنا يقدم دليلاً مفيداً لاستهداف والكشف عن الترجمة التي يسببها سينيوب تعزيز مرناً المنشودة وتوفير أداة جديدة لتنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة جزئيا تدعمها منصة برنامج التكنولوجيا والعلوم الأساسية “الطب البيولوجي المبتكرة”، ورقم 17 وأنا 0301014، من وكالة اليابان “البحوث الطبية” والتنمية (AMED)، “منحة بحثية” من يأمرون بمركز الحياة بتبريد تكنولوجيا العلوم ومنحة بحثية من يأمرون بنظام الرصد الدولي بتبريد. ونشكر أعضاء مختبر الكمبيوتر والشبكة سينوب (SISSA وجامعة بيدمونت الشرقية بتبريد) لمناقشات شاحذة للفكر. ونحن نشكر الدكتور ماثيو الحب لتصحيح التجارب المطبعية.
Materials
| Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
| HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
| Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
| pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
| PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
| DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
| Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
| Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
| GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
| Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
| Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
| ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
| Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
| Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
| TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
| PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
| Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
| Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |
References
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309 (5740), 1564-1566 (2005).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- Hon, C. C., et al. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5′ ends. Nature. 543 (7644), 199-204 (2017).
- Tufarelli, C., et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nature Genetics. 34 (2), 157-165 (2003).
- Yu, W., et al. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA. Nature. 451 (7175), 202-206 (2008).
- Carninci, P., Hayashizaki, Y. Noncoding RNA transcription beyond annotated genes. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 139-144 (2007).
- Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter. Nucleic Acids Research. 38 (21), 7736-7748 (2010).
- Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 509-524 (2014).
- Takahashi, H., Carninci, P. Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (2), 294-301 (2014).
- Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
- Nishina, K., et al. DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing. Nature communications. 6, 7969 (2015).
- Carrieri, C., et al. Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat. Nature. 491 (7424), 454-457 (2012).
- Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells. Scientific Reports. 6, 33605 (2016).
- Zucchelli, S., et al. SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174 (2015).
- Takahashi, H., et al. Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation. PLOS ONE. 13 (2), e0183229 (2018).
- Deutschbauer, A. M., et al. Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast. Genetics. 169 (4), 1915-1925 (2005).
- Indrieri, A., et al. Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo. Scientific Reports. 6, 27315 (2016).
- Patrucco, L., et al. Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins. Gene. , (2015).
- Sasso, E., et al. A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells. MAbs. , 1-8 (2018).
- Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications. European Journal of Human Genetics. 16 (11), 1350-1357 (2008).
- Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs. Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24 (15), 1634-1644 (2010).
- Watts, J. K., Corey, D. R. Silencing disease genes in the laboratory and the clinic. Journal of Pathology. 226 (2), 365-379 (2012).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Liu, X., Harada, S. RNA isolation from mammalian samples. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Severin, J., et al. Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU. Nature Biotechnology. 32 (3), 217-219 (2014).
- Yao, Y., et al. RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat. Nucleic Acids Research. 43 (9), e58 (2015).
- Savić, N., Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Translational Research. 168, 15-21 (2016).
- Long, H., et al. RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy. Biotechnology Letters. , (2016).
