סינתזה של ששינינו רך-אוריאה אלסטומרי ליישום עדשה תוך-עיני

אזהרה: נא עיין כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. מספר כימיקלים המשמשים syntheses התערוכה רעילות חריפה וגירוי חזק את העור ואת העיניים, כמו גם בשאיפה. בבקשה ללבוש ציוד מגן אישי (מעבדה מעילים בטיחות משקפיים, כפפות יד, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות), להתמודד עם הכימיקלים, במידת האפשר, תחת ברדס fume או במקום מאוורר היטב. לבצע כל syntheses מתחת למכסה המנוע fume. Tetramethylammonium הידרוקסיד pentahydrate (TMAH): TMAH הוא בסיס חזק, בחריפות רעילים אם בלע, בעת מגע עם העור הוא גורם לכוויות קשות כימי על העור והעיניים. זה רגיש אוויר והוא היגרוסקופי. אחסן אותו תחת חנקן מתקני קירור. לטפל TMAH במקום מאוורר היטב בגלל ריחו חזק כמו אמוניה. APTMDS: APTMDS רגיש אוויר ויש לאחסן תחת חנקן. זה גורם לכוויות חמורות העור ונזקי עין. H12MDI: H12MDI הוא רעיל על שאיפת וגורם גירוי העור והעיניים. D4: יח4 עשוי לפגום פוריות. THF: THF מזיק, גורם לגירוי בשאיפה, והוא ככל הנראה מסרטנים. כלורופורם (CHCl3): CHCl3 מזיקים בשאיפה, ככל הנראה מסרטנים, יכול לגרום נזק אפשרי פוריות של העובר ושל האדים שלו עלול לגרום לנמנום. 1. סינתזה של זרז, אמינו המסתיימת ששינינו Macromonomers סינתזה של הזרז tetramethylammonium-3-aminopropyl-dimethylsilanolateהערה: הזרז סונתז בהתאם לשיטה שדווחו על-ידי הופמן, ליר44. דגה APTMDS תחת ואקום לפני השתמש ואחסן אותו תחת חנקן. פיפטה כ 10 גרם של APTMDS באמצעות מזרק. הוסף 8.13 g (33.0 mmol) של degassed APTMDS ו- g 11.88 (66.0 mmol) של TMAH לתוך בקבוקון 100 מ ל 3-צוואר עגול-התחתון. הוסף 20 מיליליטר THF להתמוסס APTMDS ו להשעות את TMAH, יחד עם בר גדול מערבבים מגנטי סגלגל.התראה: TMAH הוא חומר היגרוסקופי קורוזיבי, רעיל עם ריח חזק של אמוניה דמוי ויש לאחסנו בחוזקה חתום במקרר. שוקל TMAH מיד במקום מאוורר היטב; ללבוש כפפות מגן היד, בטיחות משקפיים תוך כדי טיפול. APTMDS אוויר רגיש, גורמת לכוויות עור ונזקי עין. שוקל APTMDS מתוך בקבוק אטום באמצעות מזרק; ללבוש כפפות מגן היד, בטיחות משקפיים תוך כדי טיפול. לצייד את הבקבוק העגול-התחתון שלוש-צוואר עם הקבל ריפלוקס, פתחי הכניסה, שקעים עבור חנקן ומחממים תערובת התגובה עד 80 ° C באמצעות גליצרין או סיליקון שמן חימום לאמבטיה. מערבבים את תערובת התגובה כבר שעתיים תחת ריפלוקס, עם זרימה קלה, רציף חנקן.הערה: המתלה ראשונית, מעט עכורים משתנה פתרון ברור בתוך שעתיים. הסר את מעבה ריפלוקס, לזקק את THF באמצעות ליניקת אבק. לאחר מכן, יבש המוצר גסה מעט צהבהב תחת ואקום של 0.1 mbar עבור 5 שעות ב 70 ° C באמצעות שורת schlenk.הערה: לאחר שלב זה, המוצר גסה ניתן לאחסן במקרר ב 10 ° C עד למחרת היום. Resuspend את המוצר הגולמי ב- 50 מ של THF. במידת הצורך, להשתמש במרית לגרוס agglomerates גדולים, ולסנן את המתלים. באמצעות ליניקת אבק. רחץ x לפחות 3 precipitate עם 20 מ ל THF חלקים עד שהמוצר הופך מוצק, כמו אבקה לבנה. יבש את המוצר תחת ואקום של 0.1 mbar בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות. לאחר מכן, לאחסן את הזרז במקרר ב 10 ° C תחת חנקן עד לשימוש. סינתזה של Α, ω-bis(3-aminopropyl)-polydimethylsiloxanesהערה: סינתזה של PDMS עם משקל מולקולרי של ~ 15,500 g·mol-1. דגה D4 ו- APTMDS תחת ואקום לפני השימוש. פיפטה כ 1.5 גר’ APTMDS, באמצעות מזרק. הוסף 19.5 g (65.7 mmol) של degassed D4 ו- g 0.9 (3.6 mmol) של APTMDS לתוך בקבוקון סיבוב למטה שלוש-צוואר 100 מ ל, אשר מצויד עם מצופים PTFE קדירות צנטריפוגלי ו חנקן כניסת עודפים. מוסיפים ~ 26 מ ג של הזרז (מתוך סעיף 1.1) ומערבבים את תערובת התגובה למשך 30 דקות ב 80 ° C תחת זרימה קלה, רציף חנקן.הערה: שמן גליצרין או סיליקון חימום לאמבטיה ניתן להשתמש. להוסיף 45.5 גרם (153.4 mmol) ד4 dropwise תערובת התגובה, באמצעות משפך יורד (במרחק של 2-3 h), ומערבבים עוד ב 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה תחת זרימה רציפה חנקן.הערה: התגובה יכולה להמשיך בין לילה. מחממים את התערובת התגובה עד 150 ° C ומערבבים זה כבר שעתיים לפרק את הזרז. לאחר מכן, לאפשר את PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. להחליף את קדירות צנטריפוגלי עם בר גדול מערבבים מגנטי סגלגל, לאטום את הבקבוק העגול-התחתון שלוש-צוואר עם שני פקקים. השתמש במתאם עם שסתום וחום לאט את PDMS עד 150 ° C תחת ואקום של 0.1 mbar לזקק את המוצרים בצד מחזורית באמצעות שורת schlenk. אפשר את PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר.הערה: זיקוק בואקום מתרחשת בדרך כלל ב- 4-5 שעות. סינתזה של α, ω-bis(3-aminopropyl)-polydimethyl-מתיל-phenylsiloxaneהערה: סעיף זה מתאר את השגרה סינתזה ששינינו עם משקל מולקולרי של ~ 15,500 g·mol-1 ו- siloxane מתיל-phenyl מול 14%; ההליך זה להשוות הסינתזה PDMS, אשר המתוארת בסעיף 1.2. דגה D4 ו- APTMDS תחת ואקום לפני השימוש. פיפטה כ 1.5 גר’ APTMDS באמצעות מזרק. המקום D4לי, Ph -70 מעלות צלזיוס במשך 3-5 h בתוך תא ואקום כדי להמיס לחלוטין, homogenize את המוצר לפני השימוש. הוסף g 4.54 (15.3 mmol) ד4, 14.96 g (27.5 mmol) של ד4. Phו- g 0.9 (3.6 mmol) של APTMDS לתוך בקבוקון סיבוב למטה שלוש-צוואר 100 מ ל, אשר מצויד עם מצופים PTFE קדירות צנטריפוגלי ו חנקן כניסת עודפים. מוסיפים ~ 26 מ ג של הזרז (מתוך סעיף 1.1) ומערבבים את תערובת התגובה ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת זרימה רציפה חנקן. להוסיף 45.5 גרם (153.4 mmol) ד4 dropwise לתערובת התגובה, באמצעות משפך יורד (במרחק של 2-3 h), ומערבבים עוד ב 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה תחת זרימה רציפה חנקן.הערה: התגובה יכולה להמשיך בין לילה. להמשיך הסינתזה על-ידי ביצוע שלבים 1.2.5 ו 1.2.6. 2. משקל מולקולרי קביעת ששינינו תאורטית המשקל המולקולרי של ששינינו לחשב את המשקל המולקולרי תיאורטי של ששינינו לפי המשוואה הבאה:(1)כאן, של מספר משקל מולקולרית ממוצעת של polydimethylsiloxane, m היא המסה (g) של מונומרים בשימוש D4 ו- APTMDS ו- n הוא הסכום של APTMDS ב שומות. קביעת משקל מולקולרי ששינינו מאת 1H-NMR ספקטרוסקופיה להמיס 10-20 מ”ג של ששינינו ב- 0.5 מ של CDCl3, להקליט את ספקטרום NMR, לכייל כימי במשמרות [אלפא] לאות הממס-7.26 ppm. לחשב את המשקל המולקולרי של ששינינו מתוך הערכים נפרד לפי המשוואה הבאה.(2) קביעת משקל מולקולרי ששינינו באמצעות טיטור להוסיף 1.5-2 גר’ ששינינו לתוך בקבוקון חרוט 250 מ ל, לפזר זאת בתוך 50 מ של THF תחת ערבוב רציף באמצעות פס מגנטי מערבבים. Titrate אמינו קבוצות עם 0.1 M HCl באמצעות bromophenol כחול עד לשנות צבע כחול לצהוב נצפית. חזור על טיטרציה עם שלוש דוגמאות כדי לחשב את המשקל המולקולרי ממוצע מספר. 3. סינתזה של אלסטומרים ששינינו-אוריאה הערה: סעיף זה מתאר את השגרה סינתזה אלסטומר אוריאה המבוסס על PDMS של 10 w % קשה-קטע תוכן (HS %) (PDMS: 15,500 g·mol-1). (3) הוסף 2.939 g (11.2 mmol) של H12MDI לתוך בקבוקון ארבע-צוואר עגול למטה תגובה 250 מ ל, אשר מצויד עם מצופים PTFE צנטריפוגלי קדירות, נשירה משפך, ואת כניסת חנקן ו שקע, ‘ לפזר זאת בתוך 20 מיליליטר THF.התראה: H12MDI diisocyanate נדיף נמוך, גורם גירוי העור והעיניים. ללבוש כפפות מגן יד ומשקפיים בטיחות.הערה: לחלופין, להמיס H12MDI שבשנות ה בתוך 50 מ ל ולהוסיף הפתרון באמצעות משפך או זכוכית צבעוני לתוך הבקבוק התגובה. לאחר מכן, לשטוף את הספל, משפך עם 10 מ”ל של THF. להמיס 45.0 g (2.9 mmol) של PDMS degassed ב- 100 מ של THF; להוסיף פתרון זה dropwise לתוך הפתרון MDI12H באמצעות משפך יורד מתחת ערבוב רציף והזרמת חנקן בטמפרטורת החדר. לשטוף את. הספל ושחרור משפך עם 50 מ של THF ולהוסיף פתרון זה תערובת התגובה. לשלוט על היווצרות של ספקטרוסקופיה FTIR prepolymer דרך .הערה: התקדמות התגובה ניתן לנטר בשתי דרכים: באמצעות מוטבעת או ספקטרוסקופיה ATR-FTIR במצב לא מקוון. ספקטרוסקופיה מוטבעת ATR-FTIR, להוסיף של בדיקה ATR-FTIR בתוך השורה, אשר מחובר את ספקטרומטר, לתוך המפרק המרכזית בתחילת התגובה. השתמש בר מערבבים מגנטי סגלגל גדול במקום קדירות מצופים PTFE. להתחיל להקליט את הספקטרום של הפתרון MDI12H ובחר הפסגה הקליטה המש ב 2266 ס מ-1 כדי לבצע את ההמרה של קבוצות isocyanate. עבור ספקטרוסקופיה ATR-FTIR מנותק, לקחת דגימות של תערובת התגובה באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף כמה טיפות על הגביש ATR. להתנדף הממס תחת זרם חנקן עד דקה בסרט נשאר על פני קריסטל ATR. ספקטרה הרשומה שלבי תגובה אחרת (לאחר תוספת מלאה של PDMS ואחרי התוספת של כל חלק של APTMDS). להוסיף חלקים הכמות stoichiometric של שרשרת ב- extender APTMDS הפתרון prepolymer.הערה: התוספת של שרשרת ב- extender להתקדם בשני אופנים (ראה שלבים 3.1.3.1 ו 3.1.3.2). להמיס כמות שרשרת ב- extender ב 5-10 מ ל THF שנשקל ולהוסיף את הפתרון dropwise לתערובת תגובה באמצעות פיפטה פסטר או באמצעות משפך יורד, ולאחריה שטיפה שוב עם 3 מ”ל של THF. להוסיף חלקים ב- extender שרשרת לתוך מזרק ולהוסיף שרשרת ב- extender dropwise לתערובת התגובה. במקרה זה, חותם את המקום הרביעי באמצעות פקק גומי מחצה. הוסף 1.65 g (6.6 mmol) של APTMDS, המקביל ל-80% הסכום המחושב של APTMDS, prepolymer. לאחר מכן, בקרת התקדמות התגובה בעזרת FTIR ספקטרוסקופיה. ואז, להוסיף תערובת התגובה 0.21 גר’ (0.8 mmol) APTMDS (ב, סה כ 90% מן הסכום המחושב) ושליטה התקדמות התגובה על ידי FTIR. להוסיף 0.1 גר’ (0.4 mmol) APTMDS (ב, סה כ 95%) תערובת התגובה, שליטה התגובה התקדמות בעזרת FTIR. לבסוף להוסיף את החלק האחרון של שרשרת ב- extender (0.102 g, 0.41 mmol) לתערובת התגובה, בדוק את היעלמותה של הלהקה הקליטה המש בספקטרום FTIR.הערה: לאחר התוספת של החלק הראשון של שרשרת ב- extender, עלייה צמיגות יצויין. יוצקים את הפתרון ספק כח לתוך כוס PTFE רדיד-מכוסה פטרי, מתאדים הממס ללון מתחת למכסה המנוע fume. יתר על כן, יבש את כח בתוך תא ואקום ב 80 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. 4. הליך הבדיקה מכני הכנת סרטים elastomer ששינינו-אוריאה להמיס 7-8 גר’ חתיכות קטנות של ספק הכוח ב- 200-250 מ של CHCl3 בבקבוקון חרוט 300 מ”ל, באופן רופף לאטום את הבקבוקון באמצעות פקק זכוכית, ומערבבים את התערובת בעזרת פס מגנטי מערבבים במשך לפחות 24 שעות. אם יש צורך, להוסיף חלקים נוספים של הממס.זהירות: כלורופורם היא ככל הנראה מסרטנים. ואדים עלול לגרום לנמנום על שאיפה. להתמודד עם הכלורופורם במקום מאוורר היטב. להוסיף את הפתרון הומוגנית לתוך כוס, צלחת פטרי, לכסות אותו ברדיד אלומיניום מחורר. לאפשר הממס מתמוססות אט-אט גם על ידי הצבת הפטרי במקום מאוורר היטב או בשכונה fume סאש בחלון פתוח.הערה: בעת הצבת הפטרי בשכונה fume, להקטין את זרימת האוויר במידת האפשר. אידוי מהיר מאוד של הממס מוביל inhomogeneity היווצרות של כתמים אטום בתוך הסרטים שקוף. יבש את הסרט ב 80 מעלות צלזיוס בתוך תא ואקום במשך 12 שעות. בזהירות להסיר את הסרט במשטח זכוכית בעזרת מרית דק קטן ולאחסן את הסרט כח בתוך מעטפה שקופה על השימוש הבאים עבור אפיון מכני. בדיקות מתח-זן ששינינו-אוריאה אלסטומר סרטים היכונו למות לחתוך לכלב עצמות-בצורת דגימות מן הסרטים כח לפי Keiper45 (סוג S2). מקם את הסרט כח, המכוסה על ידי foils מעטפה, תחת יחידת הסכין חבטות בצורת כמוצג באיור4. לדחוף את הידית אגרוף הדגימה הבדיקה ואחסונו במשך לפחות 72 h בטמפרטורת החדר (23 ± 2 ° C). . הפעילי את מכונת בדיקות מתיחה והמחשב להפעיל את התוכנה על ידי לחיצה על הסמל. בחר את שיטת בדיקת מתיחה , בדוק אם התא הנכון עומס (100 N) מותקן במכונה הבדיקה. בחר שיטה העוזרת ולבדוק אם כל בדיקת הגדרות נכונות. ללכת pre-test ולבדוק אם ההגדרות הבאות מופעלים: אורך הדגימה המקורית (L0)-20 מ מ של preload-0.1 MPa, את מהירות עד preload ב- 5 מ מ/דקה. ללכת לבדוק פרמטר ולבדוק אם ההגדרות הבאות מופעלים: המהירות מצפני האלסטיות ב- 1 מ מ/דקה, המהירות עד מדגם בבאג 25 מ מ/דקה, זיהוי הדגימה בבאג-80% Fמקסימום, קביעת האלסטיות-רגרסיה, תחילתו של נחישות מודולוס של יאנג ב- 2% זן, וסופו של נחישות מודולוס של יאנג ב- 6% זן. להשאיר את השיטה עוזרת ולעבור החלון הראשי של התוכנה. הכפתור על כוח על מכונת בדיקות ולחץ על לחצן ללכת לנקודת ההתחלה בחלון הראשי של התוכנה. להסיר את האלומיניום הגנה ולבדוק את הדגימה תחת הצלב-מקטב כדי לא לכלול כל מתח פנימי. למדוד את הדגימה עובי ורוחב מדגם באמצעות נשק. לאחר מכן, הכנס את הערכים עבור מדגם עובי ורוחב השדות המתאימים בחלון הראשי של התוכנה. לתקן את הדגימה הבדיקה בין הלסתות clamping העליון של המכונה בדיקה. לחץ על לחצן אפס כוח בתוך החלון הראשי של התוכנה. לתקן את הקצה התחתון של הדגימה הבדיקה בין החלק התחתון מחבר חובק למעקה מלתעות של המכונה בדיקה.הערה: אם המשטחים של הלסתות clamping חלקלק, מקם את הקצוות של הדגימה בין פיין-תבואה אמרי נייר כדי למנוע החלקה במהלך המדידה הדגימה. לחץ על לחצן המדידה התחל כדי להתחיל את המבחן מתיחה. לאחר שסיים את המדידה, להמשיך עם שלבים 4.2.6 ו 4.2.7. לאחר תיקון הדגימה הבדיקה בין הלסתות clamping העליון ובחירה אפס כוח, בחר את לחצן ללכת לנקודת ההתחלה על החלון הראשי של התוכנה. לאחר מכן, לתקן את הקצה התחתון של הדגימה הבדיקה בין החלק התחתון מחבר חובק למעקה מלתעות ולחץ המדידה התחל שוב. חזור על שלבים 4.2.6 – 4.2.8 עבור ספק כח דוגמא אחת לפחות 3 x נוספים על הערכה סטטיסטית של מודולוס של יאנג, חוזק, התארכות בהפסקה. היסטרזיס בדיקות על כח elastomer סרטים . הפעילי את מכונת בדיקות מתיחה והמחשב להפעיל את התוכנה על ידי לחיצה על הסמל. בחר את שיטת בדיקת מתיחה מחזורית וסמנו את ההתקנה של תא המטען הנכון (100 N) במכונה בדיקה. בחר שיטה העוזרת ולבדוק אם כל בדיקת הגדרות נכונות. ללכת pre-test ולבדוק אם ההגדרות הבאות מופעלים: אורך הדגימה המקורית (L0)-20 מ מ של preload-0.05 MPa, את מהירות עד preload ב- 5 מ מ/דקה. לעבור מבחן פרמטר ולבדוק את ההפעלה של ההגדרות הבאות: מספר מחזורים בשעה 10, setpoint טעינה ב 100% מאמץ, setpoint פריקת מתח 0%, וכן את המהירות-25 מ מ לדקה לעזוב את השיטה עוזרת ו מעבר אל החלון הראשי של התוכנה. להמשיך עם שלבים 4.2.5 – 4.2.8. חזור על המדידות היסטרזיס עם שתי דגימות הערכות סטטיסטיות. לחשב את היסטרזיס מכני עבור כל מחזור לפי המשוואה הבאה.(4) 5. טיפוח נוהל תאים HaCaT לחמם את cryotube עם HaCaT תאים ולשנות של Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) בתוך אמבט מים 37 º C. תחת עבודה, שעליו מונחים בטיחות מיקרוביולוגית, במהירות העברה התליה תא שפופרת צנטרפוגה חרוט 10 מ”ל, אשר מלא DMEM חמים. נושא התליה תא צנטריפוגה במשך 6 דקות ב x 845 גרם. למחוק את רוב תגובת שיקוע באמצעות כוס חד פעמית פסטר פיפטה, אשר מצורף של משאבת ואקום, resuspend בגדר תא בתוך הנוזל הנותר על ידי בעדינות pipetting את agglomerates תא למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של גלאים. להעביר את התאים resuspended בקבוקון תרבות 25 ס מ תא2 ולהוסיף 9 מ של DMEM, אשר השלים עם 10% FBS. דגירה התאים-37 ± 1 ° C ו- 5% CO2 באינקובטור בארון. לשלוט על התפשטות תאים ביום בעזרת מיקרוסקופ הפוכה. לשנות את DMEM כל יום שלישי עד התאים הופכים subconfluent. לבצע מעבר תא תחת בטיחות עבודה, שעליו מונחים על-ידי הסרת את DMEM באמצעות כוס חד פעמית פסטר פיפטה. להוסיף 10 מ של PBS מאגר לכבס שהשכבה תא. הסר את המאגר הציבורי באמצעות כוס חד פעמית פסטר פיפטה שוב. להוסיף 1 מ”ל של פתרון טריפסין/EDTA 25 ס מ2 תא תרבות שתייה צידניות כדי לנתק את התאים ואת דגירה אותם בחממה CO2 ארון. בדוק אם התאים נמצאים ההשעיה, שימוש במיקרוסקופ הפוכה. להוסיף 3 מ”ל של DMEM תא תרבות שתייה צידניות כדי להשבית את טריפסין. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה, נושא את התאים צנטריפוגה במשך 6 דקות ב 845 x גרם. הסר את רוב תגובת שיקוע, באמצעות כוס פסטר פיפטה. Resuspend התאים DMEM הנותרים ולהוסיף 10 מ”ל של טרי DMEM חם, אשר השלים עם 10% FBS. להעביר 5 מ של התליה תא לתוך כל אחד 75 ס מ2 תא תרבות המבחנות ולהוסיף 15 מ”ל של DMEM חמים טריים, בתוספת 10% FBS. לטפח HaCaT תאים-37 ± 1 ° C ו- 5% CO2 בחממה CO2 ארון עד התאים הופכים subconfluent. חזור על המעבר תא על-פי השלבים 5.1.3 – 5.1.6 אבל הפעם, השתמש 2 מ”ל של פתרון טריפסין/EDTA, 6 מ של DMEM כדי להשבית את טריפסין. 6. נוהל MTS תא הכדאיות Assay באמצעות תאים HaCaT הערה: במבחנה cytotoxicity בדיקות בוצעו על פי Wenzelewski46, באמצעות תמציות בינוני התא. ספק כח דוגמאות ודוגמאות פוליאוריתן ביו-כיתה חיטוי באמצעות אתילן אוקסיד. התרבות התאים HaCaT-37 ± 1 ° C ו- 5% CO2 ב- DMEM, אשר השלים עם 10% FBS בבקבוקון 75 ס מ2 תא תרבות. השתמש בתאים לבדיקות במבחנה cytotoxicity, לפחות אחרי המעבר הרביעי. להוסיף דוגמאות עקר כח וחומר עזר (0.7 גרם) 50 מ ל צנטריפוגה חרוט צינורות ולחלץ את הדגימות עם DMEM, בלי FBS, במשך 72 ± 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 -יחס החילוץ של 0.1 g/mL. השתמש תמציות שלושה עבור כל דגימה של ספק הכוח. להכין דגימות עיוור על ידי מילוי DMEM, בלי FBS, לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ ל, לבצע את החילוץ אותו. ביום 2 של ההליך החילוץ, לבצע ניתוק התא על פי שלבים 5.1.3 – 5.1.5 2 מ של טריפסין/EDTA, 6 מ של DMEM. קח את µL 100 aliquot של התליה תא ולהוסיף 100 µL של DMEM. ההשעייה מדולל, לקחת 20 µL של aliquot, להוסיף 10 µL של פתרון trypan blue 0.5% כתם תאים מתים. דגירה את התאים עבור 2 דק למלא hemocytometer באמצעות micropipette ולספור מיד את התאים בתוך התאים ארבע. לחשב את המספרים של תאים nonviable ובר קיימא להערכת הכדאיות תא באחוזים.הערה: לחלופין, התאים ניתן לספור באמצעות תא ספירת המערכת. HaCaT זרע תאים (פסקה רביעית)-ריכוז של 20 x 103 תאים/טוב ב 200 µL של DMEM לתוך microplates 96-ובכן, דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%2. יום 3, אחרי החילוץ, להוסיף 10% FBS לכל אחד של תמצית, עיוור דגימות וחם הדגימות עד 37 ° C שימוש באמבט מים. להסיר את DMEM מכל נזרע טוב ולהחליף המדיום תמציות, דגימות עיוור ועל הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים. עבור כל ספק כח לחלץ (שימוש, שלוש תמציות עבור כל דגימה כח), פיפטה µL 200 של התמצית לתוך בארות שש. פיפטה µL 200 המדגם עיוור (DMEM + 10% FBS) לתוך בארות שש. פיפטה 200 µL של DMEM טריים, בתוספת 10% FBS (בקרה שלילית), לתוך בארות שש. פיפטה µL 200 של הפקד חיובי (DMEM + 10% FBS + 1% מרחביות) לתוך בארות שש. דגירה התאים עם תמציות, פקדים עבור 24 שעות-CO 37 ° C ו-5%2.הערה: עבור הכנת פקד חיובית, להכין פתרון מרחביות 20% במים, לדלל את זה עם DMEM-1:2. לאחר מכן, בהמשך לדלל את זה עם DMEM להכין פתרון מרחביות 1% יום 4, זמן קצר לפני סוף זמן הדגירה, להכין פתרון מניות של MTS, DMEM ללא FBS (עבור כל טוב, µL 20 שימוש בפתרון MTS + 100 µL של DMEM). לאחר זמן הדגירה, להסיר את תמציות, פתרונות עיוור ופקדים, פיפטה µL 120 של הפתרון MTS מלאי כל טוב, כמו גם לתוך בארות שש ללא תאים כדי לקבוע את הרקע. דגירה התאים במשך 4 שעות-CO 37° C ו-5%2. יום 4 לאחר הדגירה של הפתרון MTS, למדוד את ספיגת כל הבאר-492 nm, שימוש בקורא microplate. להחסיר את ספיגת מדודה של רקע מזו של הבארות הזריעה. להניח הערכים ספיגת נמדד מהפקד חיובי מייצגים התפשטות 0% להגדיר ערכים אלה ספיגת ל- 0. להניח הערכים ספיגת נמדד מהפקד שליליים מייצגים התפשטות 100% להגדיר ערכים אלה ל- 100. לחשב את התפשטות תאים מתוך הערכים ספיגת כאחוז של הערכים ספיגת שליטה שלילי (100% הפצה), בקרה חיובית (0% הפצה). הערכת תמציות מדגם כי התערוכה התפשטות תאים עד 81% כמו לא ציטוטוקסיות.הערה: על פי מידע של הספק47, למדוד את ספיגת מאוחר יותר. פיפטה 25 µL של 10% הפתרון מרחביות לבאר כל לעצור את התגובה ולאחסן את microplate עבור עד 18 שעות מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified.