A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Valentin Dunsing; Salvatore Chiantia

doi:10.3791/58582

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Biochemistry

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

Published: December 01, 2018

doi:

10.3791/58582

Valentin Dunsing, Salvatore Chiantia

¹Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group,University of Potsdam

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोण को सेल-सेल बातचीत मध्यस्थता प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच, यानी प्रोटीन सेल जंक्शनों में स्थानीयकृत, सीधे रहने वाले कोशिकाओं में । हम साधन अंशांकन, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण, संभव मूर्ति स्रोतों को सुधार सहित पर विस्तृत दिशानिर्देश प्रदान करते हैं ।

Abstract

जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म सेल सेल बातचीत, आम तौर पर प्रोटीन है कि पड़ोसी कोशिकाओं के बीच इंटरफेस पर बातचीत से मध्यस्थता शामिल है । ब्याज की, केवल कुछ परख विशेष रूप से ऐसी बातचीत के रहने की कोशिकाओं में सीधे जांच करने में सक्षम हैं । यहां, हम एक परख प्रस्तुत करने के लिए प्रोटीन के बंधन को मापने के पड़ोसी कोशिकाओं की सतहों पर व्यक्त की, सेल में सेल संपर्क । यह परख दो कदम होते हैं: अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े ब्याज के प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के मिश्रण, सेल में प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव स्पेक्ट्रोस्कोपी माप द्वारा पीछा किया-सेल संपर्कों एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । हम एक जैविक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में इस परख की व्यवहार्यता का प्रदर्शन amyloid के अग्रदूत-जैसे प्रोटीन 1 सेल जंक्शनों के पार (APLP1) की बातचीत को मापने । हम प्रतिदीप्ति-आधारित तकनीकों का उपयोग कर डेटा प्राप्ति पर विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं (स्कैनिंग प्रतिदीप्ति क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी, क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक विश्लेषण) और आवश्यक साधन अंशांकन । इसके अलावा, हम डेटा विश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम और कैसे की पहचान करने और बाहरी, नकली संकेत रूपांतरों, जैसे photobleaching या सेल आंदोलन के कारण उन के रूप में सही चर्चा ।

सामांय में, प्रस्तुत परख किसी भी होमो-या heterotypic प्रोटीन-सेल संपर्क में प्रोटीन संपर्क के लिए लागू है, एक ही या विभिंन प्रकार की कोशिकाओं के बीच, और एक वाणिज्यिक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर लागू किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण आवश्यकता प्रणाली है, जो कई मिनट से अधिक ब्याज की प्रोटीन की प्रसार गतिशीलता जांच करने के लिए पर्याप्त होने की जरूरत की स्थिरता है ।

Introduction

सेल-सेल इंटरैक्शन, जैसे, सेल-सेल आसंजन¹^,²^,³, सेल-सेल फ्यूजन⁴ और सेलुलर मान्यता⁵की साइटों पर कई जैविक प्रक्रियाएं होती हैं । इस तरह के आयोजन कोशिकीय जीवों के विकास के दौरान और कोशिका-कोशिका संचार के लिए, जैसे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण होते हैं । इन प्रक्रियाओं को आम तौर पर प्रोटीन है कि सतह पर स्थानीयकृत रहे हैं, अर्थात्, प्लाज्मा झिल्ली में (प्रधानमंत्री) पड़ोसी कोशिकाओं और सेल सेल संपर्क है कि ठीक अंतरिक्ष और समय में विनियमित रहे है पर विशिष्ट बातचीत से गुजरना कर रहे हैं । कई मामलों में, इन बातचीत सीधे होमो-या heterotypic प्रोटीन-प्रोटीन ट्रांस बातचीत कर रहे हैं, लेकिन यह भी आयनों या लाइगैंडों extracellular लिंकर्स¹के रूप में अभिनय को शामिल कर सकते हैं । हालांकि बुनियादी महत्व के, वहां परख की कमी है इन विशिष्ट प्रोटीन की जांच सीधे रहने वाले कोशिकाओं के मूल वातावरण में प्रोटीन बातचीत । कई तरीकों या तो सेल व्यवधान की आवश्यकता होती है (जैसे, co-immunoprecipitation⁶के रूप में जैव रासायनिक परख), निर्धारण (जैसे, सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक और कोशिका कोशिका के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के कुछ संपर्क⁷), या गैर विशिष्ट हैं, उदाहरण के लिए, एकत्रीकरण/आसंजन परख⁸^,⁹। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, प्रतिदीप्ति तकनीक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)¹⁰ या प्रतिदीप्ति पूरक¹¹के आधार पर लागू किया गया है । हालांकि, fluorophores के बीच पर्याप्त छोटी दूरी को प्राप्त करने के लिए, इन तरीकों प्रोटीन¹⁰, संभावित ट्रांस बातचीत के साथ हस्तक्षेप के extracellular ओर फ्लोरोसेंट लेबल की आवश्यकता है ।

यहां, हम एक वैकल्पिक प्रतिदीप्ति-सेल-सेल संपर्कों पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के लिए परख आधारित मौजूद हैं । यह दृष्टिकोण प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध दृष्टिकोण को जोड़ती है (स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (sFCCS), पार सहसंबंध संख्या और चमक (ccN और बी)) और एक फ्यूजन की प्रोटीन के निर्माण की कोशिकाओं का मिश्रण ब्याज, उदाहरण के लिए, एक आसंजन रिसेप्टर । दो बातचीत कोशिकाओं में जांच रिसेप्टर्स दो के साथ लेबल कर रहे हैं वर्णक्रम से अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस), intracellular पक्ष से ( चित्र 1aदेखें).

नियोजित तरीके प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव के एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के फोकल मात्रा के माध्यम से फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की प्रसार गति से प्रेरित के सांख्यिकीय विश्लेषण पर आधारित हैं । और अधिक विस्तार से, परख जांच सह सेल में दोनों पड़ोसी पीएमएस में ब्याज की प्रोटीन के प्रसार सेल संपर्क । यदि प्रोटीन ट्रांस बातचीत से गुजरना, इन ट्रांस परिसरों दोनों वर्णक्रमीय चैनलों में उत्सर्जक फ्लोरोसेंट प्रोटीन ले जाएगा, दोनों उत्सर्जक के प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव के कारण । दूसरी ओर, अगर कोई बाध्यकारी होता है, पीएमएस सामना करने में प्रोटीन की संख्या में उतार चढ़ाव स्वतंत्र होगा, जिससे कोई उतार चढ़ाव के कारण । अधिग्रहण दो मायनों में किया जा सकता है: 1) sFCCS एक लाइन के आकार का सेल सेल संपर्क भर में स्कैन पर आधारित है और प्रभावी ढंग से संपर्क क्षेत्र में स्थित एक स्थान में बातचीत की जांच । प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव का एक लौकिक विश्लेषण के माध्यम से, sFCCS भी गतिशीलता जानकारी प्रदान करता है, यानी, प्रोटीन परिसरों के प्रसार गुणांक; 2) ccN और बी सेल सेल संपर्क क्षेत्रों में अधिग्रहीत छवियों के एक अनुक्रम के एक पिक्सेल वार विश्लेषण पर आधारित है । यह जांच करने के लिए और पूरे संपर्क क्षेत्र (एक फोकल विमान में) के साथ बातचीत का नक्शा करने की क्षमता है, लेकिन गतिशीलता पर जानकारी प्रदान नहीं करता है । दोनों तरीकों आणविक चमक, यानी के एक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है , औसत प्रतिदीप्ति एकल फैलाना प्रोटीन परिसरों द्वारा समय इकाई में उत्सर्जित संकेत और, इस प्रकार, पर प्रोटीन परिसरों के stoichiometry का अनुमान प्रदान कक्ष-कक्ष संपर्क ।

इस अनुच्छेद में, हम नमूना तैयारी, साधन अंशांकन, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक वाणिज्यिक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर प्रस्तुत परख करते हैं । प्रयोगों फोटॉन गिनती या एनालॉग डिटेक्टरों और उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य के साथ सुसज्जित किसी भी साधन पर प्रदर्शन किया जा सकता है । हम आगे प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा और कई artefactual संकेत उतार चढ़ाव के कारण प्रक्रियाओं के लिए सुधार योजनाओं प्रदान करते हैं, जैसे, डिटेक्टर शोर, photobleaching या सेल आंदोलन । मूलतः अनुयाई कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने के लिए विकसित, परख निलंबन कोशिकाओं के लिए संशोधित किया जा सकता है, या मॉडल झिल्ली प्रणालियों के लिए अनुकूलित, उदाहरण के लिए, विशाल unilamellar बुलबुले (GUVs) या विशाल प्लाज्मा झिल्ली बुलबुले (GPMVs), की अनुमति विभिन्न लिपिड वातावरण में या एक संगठित cytoskeleton¹²^,¹³के अभाव में बातचीत के ठहराव.

स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध¹⁴ स्पेक्ट्रोस्कोपी का एक संशोधित संस्करण है और विशेष रूप से लिपिड झिल्ली¹⁵में धीमी गति से प्रसार गतिशीलता जांच करने के लिए बनाया गया था । यह ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त पीएम को सीधा एक लाइन स्कैन अधिग्रहण पर आधारित है । दो अलग लेबल प्रोटीन प्रजातियों की बातचीत की जांच करने के लिए, अधिग्रहण दो लेजर लाइनों और दो का पता लगाने खिड़कियों के लिए वर्णक्रम से अलग fluorophores का उपयोग करने में किया जाता है । पीएम (D ≤ ~ 1 µm²/) में प्रोटीन की धीमी प्रसार गतिशीलता के कारण, एक क्रॉस-टॉक-फ्री माप लाइन से¹⁵लाइन के लिए उत्तेजना योजना बारी द्वारा किया जा सकता है । विश्लेषण के साथ शुरू होता है: 1) एक संरेखण एल्गोरिथ्म पार्श्व सेल आंदोलन के आधार पर ब्लॉक वार के लिए सही ~ १००० लाइनों का औसत, 2) अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत के साथ स्थिति का निर्धारण, यानी, प्रधानमंत्री की स्थिति, प्रत्येक ब्लॉक में और 3) स्थानांतरण सभी ब्लॉकों के एक आम मूल¹²^,¹⁵, प्रत्येक चैनल में अलग से । फिर, प्रधानमंत्री के लिए इसी पिक्सेल का एक स्वत: चयन सभी गठबंधन लाइनों (यानी, केंद्र ± २.५ σ) के योग के एक गाऊसी फिट से मध्य क्षेत्र का चयन करके किया जाता है । प्रत्येक पंक्ति में संकेत के एकीकरण प्रत्येक चैनल में झिल्ली प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला एफ (टी) पैदावार (जी = ग्रीन चैनल, आर = लाल चैनल) । ध्यान दें कि पिक्सेल आकार के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए, जैसे, < 200 एनएम, पॉइंट स्प्रेड फंक्शन के आकार को दोबारा बनाने के लिए और पीएम की स्थिति के अनुरूप इसका केंद्र ढूंढें । पर्याप्त photobleaching की उपस्थिति में, प्रत्येक चैनल में प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला एक डबल-घातांक फ़ंक्शन के साथ modeled हो सकता है और उसके बाद निम्न सूत्र के साथ ठीक किया गया:¹⁶

. 1

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस फार्मूले को प्रभावी ढंग से दोनों आयाम और प्रसार एफ (टी)^सीके सहसंबंध विश्लेषण से प्राप्त समय, पैरामीटर अनुमान है कि सही एफ (टी)से प्राप्त किया जाएगा की तुलना में सही है । फिर, प्रतिदीप्ति संकेतों के स्वत:-और परस्पर सहसंबंध फ़ंक्शंस (ACFs/CCFs) की गणना की जाती है

, (२)

, (३)

जहां δf_i = च_iक (t) –fi(t ) और i = g, r।

एक दो आयामी प्रसार मॉडल तो सभी सहसंबंध कार्यों (सीएफएस) के लिए फिट है:

. 4

यहां, N अवलोकन मात्रा में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संख्या का अर्थ है और τ_घ प्रसार समय प्रत्येक चैनल के लिए । इस मॉडल के खाते में है कि वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग में, पीएम में प्रोटीन का प्रसार होता है एक्स-जेड विमान में होता है, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) प्रयोगों के सामांय रूप से इस्तेमाल किया विंयास के विपरीत झिल्ली की जांच पर फोकल खंड¹⁷के एक्स-वाई विमान में प्रसार । कमर डब्ल्यू₀ और संरचना कारक एस, बढ़ाव w का वर्णन जेड में फोकल मात्रा के_जेड , एस = डब्ल्यू_z/w₀, एक बिंदु FCS से प्राप्त कर रहे है अंशांकन माप वर्णक्रमीय समान रंगों और एक ही ऑप्टिकल सेटिंग्स के साथ प्रदर्शन प्रसार गुणांक डी_डाई के लिए पहले से ही उपलब्ध मूल्यों का उपयोग:

, (५)

जहां τ_{डी, डाई} है मापा औसत प्रसार समय डाई अणुओं, तीन के लिए एक मॉडल फिटिंग से प्राप्त आयामी प्रसार के लिए डेटा, सभी N अणुओं का एक अंश टी के खाते में संक्रमण लेने के लिए एक एक समय लगातार τ_τ के साथ triplet राज्य:

. 6

अंत में, प्रसार गुणांक (D), आणविक चमक मान (ε) और sFCCS डेटा (rel.cc.) के सापेक्ष परस्पर सहसंबंध निम्नानुसार परिकलित किए जाते हैं:

, (७)

, (८)

, (९)

जहां G_cross(0) क्रॉस-सहसंबंध फ़ंक्शन का आयाम है और i-th चैनल में सहसंबंध फ़ंक्शन का आयाम है ।

सापेक्ष पार के इस परिभाषा-सहसंबंध, यानी अधिकतम का उपयोग कर के बजाय समीकरण 9 में मतलब है, खाते है कि विभिंन सांद्रता में मौजूद दो प्रोटीन प्रजातियों के परिसरों की अधिकतम संख्या द्वारा सीमित है लेता है कम संख्या में मौजूद प्रजातियां ।

क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक एक छवि के प्रत्येक पिक्सेल के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक पल विश्लेषण पर आधारित है नमूना में एक निश्चित स्थिति में समय पर अधिग्रहीत की, आम तौर पर शामिल ~ 100-200 फ्रेम, दो वर्णक्रमीय चैनलों के साथ ( जी = ग्रीन चैनल, आर = लाल चैनल) । लौकिक से मैं_मैं और विचरण मतलब है, आणविक चमक ε_मैं और संख्या n_मैं प्रत्येक पिक्सेल और वर्णक्रमीय चैनल में गणना कर रहे है (मैं = जी, आर)¹⁸:

, (१०)

. 11

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दिए गए समीकरणों एक सच्चे फोटॉन-गिनती डिटेक्टर के आदर्श मामले पर लागू होते हैं । एनालॉग डिटेक्शन सिस्टमों के लिए, निम्न समीकरणों¹⁹^,²⁰लागू करें:

, (१२)

. 13

यहां, एस पता चला फोटॉनों और दर्ज की गई डिजिटल गिनती के बीच रूपांतरण कारक है, readout शोर और ऑफसेट है डिटेक्टर तीव्रता ऑफसेट को संदर्भित करता है । आम तौर पर, इन मात्रा स्थिर रोशनी¹⁹, जैसे, एक चिंतनशील धातु सतह या सूखे डाई समाधान के लिए तीव्रता के एक समारोह के रूप में डिटेक्टर विचरण को मापने के आधार पर, किसी भी डिटेक्टर प्रकार के लिए, नपेed किया जाना चाहिए । ऑफसेट उत्तेजना लाइट के बिना एक नमूने के लिए गिनती की दर को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । डिटेक्टर की एक रैखिक प्रतिगमन प्रदर्शन करके (I) तीव्रता (I) भूखंड, एस और ¹⁹निर्धारित किया जा सकता है जुड़े विचरण:

. 14

अंत में, क्रॉस-सहसंबंध चमक प्रत्येक पिक्सेल में परिकलित की जाती है और²¹ के रूप में सामान्य रूप में परिभाषित किया जाता है

, (१५)

पार विचरण कहां है ।

लंबे समय तक रहने वाले उतार चढ़ाव को फ़िल्टर करने के लिए, सभी ccN & B परिकलन प्रत्येक पिक्सेल²²के लिए स्वतंत्र रूप से, एक मालगाड़ी फ़िल्टरिंग के बाद किया जाता है । संक्षेप में, n_मैं, ε_मैं (i = जी, आर) और बी_सीसी की गणना कर रहे हैं जैसे, 8-15 फ्रेम के क्षेत्रों फिसलने । इस प्रकार प्राप्त मूल्यों तो अंतिम पिक्सेल संख्या और चमक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए औसत किया जा सकता है ।

Stoichiometry विश्लेषण
आदेश में सेल-सेल संपर्कों पर प्रोटीन परिसरों के stoichiometry का अनुमान लगाने के लिए, आणविक चमक अलग से sFCCS या ccN & B डेटा के लिए प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल में विश्लेषण किया जा सकता है । sFCCS में, प्रत्येक चैनल में प्रति मापन एक चमक मान प्राप्त किया जाता है. ccN & B में, कक्ष-कक्ष संपर्क के संगत सभी पिक्सेल की चमक हिस्टोग्राम प्राप्त की जाती है और औसत (या माध्य) मान माप के लिए प्रतिनिधि चमक के रूप में उपयोग किया जा सकता है । एक monomeric संदर्भ पर एक ही विश्लेषण प्रदर्शन करके, सभी चमक मूल्यों को सीधे पता लगाया प्रोटीन परिसरों की औसत oligomeric राज्य प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है । इस बिंदु पर, यह गैर-फ्लोरोसेंट एफपीएस कि oligomeric राज्य के एक अनुमान में परिणाम हो सकता है की उपस्थिति के लिए सही करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आमतौर पर एक होमो-dimeric संदर्भ प्रोटीन²³^,²⁴ एक रंग एसएफसी या संख्या और चमक (एन एंड बी) का उपयोग कर की चमक को मापने के द्वारा किया जाता है ।

Protocol

1. नमूना तैयारी: सेल सेल परख मिश्रण नोट: निम्न प्रोटोकॉल अनुयाई कक्षों के लिए मिश्रण प्रक्रिया का वर्णन करता है । यह निलंबन में कल्चर्ड कक्षों के लिए संशोधित किया जा सकता है । बीज एक 6-well प्ले…

Representative Results

प्रोटीन के लिए एक पहले परीक्षण-प्रोटीन संपर्क परख, यानी, sFCCS/ccN और बी माप (चित्रा 1) के बाद वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के मिश्रण, प्रोटीन है कि उंमीद न?…

Discussion

प्रायोगिक प्रक्रिया यहां वर्णित सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन ट्रांस बातचीत की जांच की अनुमति देता है, प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक, अर्थात् sFCCS और ccN और बी रोजगार । इन तरीको?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम आंशिक रूप से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) अनुदान २५४८५०३०९ द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Madlen Luckner धंयवाद ।

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110

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Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).