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Environment

Un test d’Amplification isotherme (lampe) médiée par la boucle pour une Identification rapide de Bemisia tabaci

Published: October 29, 2018
doi:
10.3791/58502
, , , , , , , , , , ,
1Department of Method Development and Analytics,Agroscope, 2Swiss Tropical and Public Health Institute, 3University of Basel, 4Swiss Federal Plant Protection Service,Federal Office for Agriculture, 5OptiGene Limited, 6Fera Science Limited, 7School of Natural and Environmental Sciences,Newcastle University, 8Department of Plants and Plant Products,Agroscope

Summary

Cet article présente le protocole pour une identification rapide pour Bemisia tabaci , basé sur la technologie d’amplification isotherme boucle-négociée (lampe). Le protocole nécessite une formation minimale de laboratoire et peut, par conséquent, être mis en œuvre sur place aux points d’entrée pour les importations de végétaux tels que les ports et aéroports.

Abstract

La mouche blanche Bemisia tabaci (Gennadius) est un parasite envahissant d’une importance considérable, la production de cultures de légumes et d’ornementales dans de nombreux pays dans le monde entier. Des pertes de rendement graves sont causées par alimentation directe et plus important encore, aussi par la transmission de plus de 100 virus pathogènes de plantes nuisibles. En ce qui concerne les autres ravageurs envahissants, accroissement du commerce international favorise la dispersion de b. tabaci aux zones situées au-delà de son aire de répartition naturelle. Les inspections d’usine importent des produits aux points d’entrée tels que les ports maritimes et aéroports sont, par conséquent, considérés comme une mesure de prévention importante. Toutefois, cette dernière ligne de défense contre les invasions de ravageurs n’est efficace que si les méthodes d’identification rapide pour des spécimens d’insectes suspects sont facilement disponibles. Parce que la différenciation morphologique entre le réglementé b. tabaci et proches sans quarantaine est difficile pour les non-taxonomistes, un test d’identification moléculaire rapide basé sur l’amplification isotherme boucle-négociée ( Technologie de lampe) a été développée. Cette publication rapporte le protocole détaillé du nouveau dosage décrivant rapidement l’extraction d’ADN, mise en place de la réaction de la lampe, ainsi que l’interprétation de sa lecture, ce qui permet d’identifier les spécimens de b. tabaci moins d’une heure. Par rapport aux protocoles existants pour la détection des spécifiques b. tabaci biotypes, la méthode développée vise toute espèce de b. tabaci complexes lors d’un essai. En outre, le test est conçu pour être appliqué sur place par les inspecteurs de la santé végétale avec une formation minimale de laboratoire directement aux points d’entrée. Validation approfondie effectuée dans des conditions sur place et laboratoire démontre que le test de lampe signalé est un outil d’identification rapide et fiable, améliorer la gestion des b. tabaci.

Introduction

La mouche blanche Bemisia tabaci (Gennadius) est un insecte ravageur envahissant qui affectent le rendement de nombreuses cultures d’importance économique y compris les plantes ornementales, les légumes, légumineuses à grains et coton1,2. À côté des dommages causés par le biais de phloème-alimentation directe, les espèces du nuit aux plantes indirectement par l’excrétion de grandes quantités de miellat sur les surfaces des feuilles et des fruits, ainsi que par la transmission de nombreuses plantes pathogènes virus1 , 3 , 4. des études génétiques récentes comparant les séquences d’ADN de la gène mitochondrial de la cytochrome c oxydase 1 (COI) a révélé que b. tabaci est une espèce complexe d’au moins 34 morphocryptic espèces3,4. Deux membres très envahissantes et nuisibles au sein de ce complexe, biotype B originaires du Moyen-Orient et la région de l’Asie mineure, ainsi que biotype Q provenant de la région méditerranéenne, ont été dispersés à l’échelle mondiale par le commerce international activités avec des produits végétaux, en particulier par le transport des plantes ornementales1,5,6. En raison de son statut de ravageurs dans le monde, l’Union internationale pour la Conservation de la Nature et ses ressources (UICN) énumérées b. tabaci parmi la « 100 au monde pires espèces exotiques envahissantes » et membres de l’espèce complexe sont des organismes réglementés par nombreux pays1,3,4.

Dans l’Union européenne (UE), b. tabaci est répertorié dans le 1AI plante santé annexe de la Directive 2000/29/CE, comme un organisme de quarantaine dont introduction en provenance de pays tiers et sa diffusion au sein de l’UE sont interdits4. Une mesure essentielle de prévention contre la prolifération d’organismes de quarantaine est l’inspection des envois de plantes aux points d’entrée (PDE) tels que les aéroports et les ports7,8. Dans le cas, un organisme de quarantaine est trouvée, l’Organisation nationale de Protection végétale (ONPV) responsable prend des mesures de rejet ou de traitement (y compris la destruction) de l’ expédition infestés9. Toutefois, les agents inspectant les importations souvent n’ont pas l’expertise taxinomique afin d’identifier précisément la vaste gamme des espèces nuisibles associés de commerce mondial de9. En particulier l’identification des stades immatures (p. ex., les œufs et larves) sans touches morphologiques distincts est pratiquement impossible pour les non-taxonomistes8,9,10. Par conséquent, pour permettre la mise en œuvre des mesures de quarantaine avec un minimum de retard, il y a un besoin d’identification sur le site alternative, rapide essais9.

Une méthode de candidat est la boucle-négociée isotherme amplification (lampe) technologie de l’ADN qui a été récemment montrée pour être une technologie appropriée pour l’identification des plantes pathogènes11,12,13. LAMPE est très spécifique, car la méthode utilise au moins deux paires d’amorces reconnaissant six différentes séquences ADN cible14. En raison de l’activité de déplacement ADN brin de l’ADN polymérase de la Bst , réactions de lampe sont effectuées sous conditions isothermes14. Par conséquent, contrairement aux classiques d’amplification génique (PCR)-fonction essais il n’est pas nécessaire pour un thermocycleur13,14. Un autre avantage sur les analyses PCR est sa capacité de résistance contre les inhibiteurs potentiels dans l’extrait d’ADN, contournant la nécessité d’une purification de l’ADN étape13. En raison de la vitesse et la simplicité du protocole, lampe même peut être effectué que dans des conditions sur place à l’aide d’un appareil portable, batterie axé sur la détection en temps réel dispositif8,15.

Un test de la lampe a été conçu en réponse à la demande d’une méthode d’identification sur place rapide de b. tabaci8. L’objectif global était d’élaborer un protocole qui peut être effectué par les inspecteurs de la santé végétale avec une formation limitée de laboratoire. Un fort accent était, par conséquent, définir sur l’optimisation de vitesse et la simplicité du protocole. Alors que des tests diagnostiques existants ont généralement été développées pour l’identification d’un ou plusieurs biotypes de b. tabaci, le nouveau dosage lampe couvre l’ensemble b. tabaci espèce complexe8,16,17 ,,18. Le problème de la diversité au taxon prononcé génétique du complexe a été résolu en utilisant des combinaisons d’amorces différentes et l’application des amorces dégénérées8. Le roman test lampe b. tabaci est conçu de telle manière que les amorces ciblent un fragment à l’extrémité 3′ du gène mitochondrial COI8. Ce gène présente une cible appropriée pour des analyses de diagnostic animal parce qu’il héberge des régions conservées suffisante pour assurer une sensibilité diagnostique pour une espèce spécifique, tout en discriminant assez entre apparentés organismes19, 20. en outre, le gène de la COI est souvent utilisé comme marqueur génétique dans les études génétiques sur la population et comme une séquence de signature à des analyses ADN barcoding, aboutissant à nombreuses entrées de séquence d’ADN dans les bases de données open source telles que GenBank et “BOLD”21 ,,22. À côté des séquences COI accessibles de b. tabaci, COI séquences d’espèces étroitement apparentées (Aleurocanthus spp [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp [N = 3], Neomaskellia andropogonis Tetraleurodes acaciaeet Trialeurodes spp [N = 4]) ont été inclus dans la conception d’amorce de cette étude et utilisées pour évaluer le diagnostic sensibilité et spécificité in silico8 .

En raison de la précision de la méthode, sa vitesse (< 1 h) et la simplicité du protocole, le test s’est avéré être appliquée sur place lorsqu’elle est implémentée dans le cadre de la procédure de contrôle d’importation à un POE Suisse8.

Protocol

1. les préparatifs Préparer des aliquotes de solution d’extraction alcaline ADN. Produire un stock de solution d’extraction de l’ADN alcaline grade moléculaire l’eau additionné de 600 µM d’hydroxyde de potassium (KOH) et 2 µM rouge de crésol.ATTENTION : KOH est une base solide dissoute dans l’eau. Éviter de renverser et de peau ou de contact avec les yeux. Diluer 30 µL de solution d’extraction de l’ADN alcaline (préparée à l’étape 1.1.1) dans des tubes de microcentrifuge de 0,5 mL et stocker les aliquotes à 4 ° C.Remarque : Utilisez la solution d’extraction de l’ADN aliquotée moins de 1 an. Préparation témoin d’amplification positive de b. tabaci (PAC). Générer des amplicons PCR le fragment d’ADN cible lampe.Remarque : Une introduction à des pratiques et des principes généraux de PCR est donnée par Lorenz23. Synthétiser ou obtenir les amorces C1-J-2195 (5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3′) et TL2-N-3014 (5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′) amplification d’un fragment de la24,de gène mitochondrial COI25. Mettre en place la réaction PCR, comme décrit dans le tableau 1. Utiliser l’ADN extrait (reportez-vous à l’étape 2.1) d’un spécimen de b. tabaci référence comme matrice d’ADN.NOTE : Éventuellement, il est possible d’extraire le b. tabaci ADN pour le CIP à l’aide d’une trousse commerciale selon les instructions du fabricant. Programmer un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 15 minutes à 95 ° C ; 45 cycles de 40 s à 95 ° C, 15 s à 45 ° C, rampe de plus de 60 s à 60 ° C, 2 min à 72 ° C ; 7 min à 72 ° C ; tenir à 4 ° C. Nettoyer le produit d’amplification PCR à l’aide d’un kit de nettoyage commercial PCR selon le protocole du fabricant et éluer le produit final dans l’eau de qualité moléculaire. Utilisez une trousse commerciale avec colorant intercalant de l’ADN pour mesurer la concentration d’ADN du produit PCR amplification selon les instructions du fabricant et diluer avec de l’eau de qualité moléculaire à une concentration de 1 ng / µL. stocker l’amplification PCR diluée produit en tant que solution mère PAC à-20 ° C.Remarque : Utilisez la solution PAC dans l’année. Compléter la solution mère de PAC (préparée à l’étape 1.2.1.5) avec 0,6 µM KOH et diluer avec de l’eau de qualité moléculaire à une concentration de 5 x 10-3 ng / µL. stocker le produit à 4 ° C.Remarque : Utilisez le PAC dans les 5 h pour la préparation de la prêt-à-utiliser b. tabaci lampe trousses décrits à l’étape suivante. Préparation prêt-à-utiliser le kit de lampe de b. tabaci (protocole pour 20 unités) Utilisation de ciseaux pour couper des bandes lampe 8-tube en deux lanières de lampe 4-tube. Identifier les tubes des bandes 4-tube lampe selon le schéma illustré à la Figure 1. Préparation de b. tabaci lampe réaction mastermix (protocole pour 80 réactions). Ajouter 1195.1 µL de prêt-à-utiliser GspSSD isotherme mélange principal (contenant GspSSD polymérase pyrophosphatase, sulfate de magnésium, désoxynucléotides, colorant de liaison double brin liaison ADN) et 717.4 µL de b. tabaci lampe apprêt mix à une 2 mL tubes de microcentrifuge. Brièvement les centrifuger vortex et le pouls. Administrer 22,5 µL de b. tabaci lampe réaction mastermix (préparé à l’étape 1.3.3.1) dans chaque tube des bandelettes de lampe 4-tube (document établi en étape 1.3.1) et centrifugeuse de l’impulsion. Vortex du b. tabaci lampe PAC (préparé à l’étape 1.2) rapidement et pulse centrifuger. Puis, ajoutez 2,5 µL dans le tube avec « PAC » de chaque bande de lampe 4-tube (Figure 1). Couvercles étroites et magasin le prêt-à-utiliser b. tabaci lampe kit unités à-20 ° C.Remarque : Les utiliser dans l’année. 2. analyse de la lampe sur place Extraction d’ADN Cure-dents stériles permet de transférer les spécimens d’insectes dans des tubes de microcentrifuge de 0,5 mL contenant 30 µL de solution d’extraction de l’ADN (préparée à l’étape 1.1.2).Remarque : Assurez-vous que les insectes sont immergés dans la solution d’extraction. Incuber les échantillons pendant 5 min à 95 ° C dans un thermomixer (300 tr/min). Brièvement les centrifuger vortex et le pouls. Test de lampe de b. tabaci Kit de lampe de b. tabaci dégel un prêt-à-l’emploi préparé à l’étape 1.3. Vortex rapidement et impulsion centrifuger.Remarque : Avec chaque kit, il est soit possible de tester deux spécimens différents ou d’analyser l’extrait d’ADN d’un spécimen capturé en double exemplaire. Ajouter 2,5 µL de l’extrait échantillon d’ADN (préparé à l’étape 2.1) dans les tubes portant la mention « S1 » et « S2 » du prêt-à-utiliser le kit de lampe b. tabaci (Figure 1). Ajouter 2,5 µL de pure solution d’extraction ADN alcaline (établie à l’article 1.1) dans le tube étiqueté « NAC » pour le contrôle négatif d’amplification (Figure 1). Vortex le prêt-à-utiliser la lampe de b. tabaci kit rapidement et centrifugeuse d’impulsion. Insérer le prêt-à-utiliser b. tabaci lampe trousses dans l’appareil d’analyse de lampe (avec mesure de la fluorescence en temps réel) ou d’une plate-forme PCR en temps réel et effectuer une analyse de l’amplification de l’ADN isotherme à 65 ° C pendant 60 min. Mesurer les températures de fusion des produits d’amplification de l’ADN en chauffant jusqu’à 98 ° C à une étape ultérieure de refroidissement (vitesse de montée de 0,05 ° C/s) à 75 ° C, tout en mesurant la fluorescence en temps réel. Lecture du test lampe Valider la lecture lampe manuellement comme suit. Si l’amplification de l’ADN ont été mesurées dans l’échantillon et la PAC, aucune amplification de l’ADN a été mesurée pour le CNA, et la température de recuit des produits d’amplification se situaient entre 80.0 et 85,5 ° C, examiner les résultats de la lampe comme POSITIVE (Figure 2). S’il n’y a aucune amplification de l’ADN dans les échantillons (c.-à-d. les tubes étiquetés S1 et S2) mais pour la PAC et CNA alors considèrent le résultat de la lampe comme négatif (Figure 2). Si l’amplification de l’ADN a été mesurée pour les échantillons, mais la température de recuit des amplicons correspondants était à l’extérieur de la gamme 80,0 \u2012 85,5 ° C, PAC a donné aucune amplification de l’ADN ou CNA a donné une amplification de l’ADN, examiner le résultat de la lampe comme Non valide (Figure 2). Vous pouvez également valider l’affichage de la lampe à l’aide de la demande de validation de lampe (fichier supplémentaires 1). Définir les espèces cibles et définissez le nombre d’échantillons analysés. Cliquez sur le bouton « générer un rapport » . Transférer l’affichage (amplification de l’ADN, oui/non, recuit produit d’amplification de température, résulte de la PAC et du CNA) du dispositif d analyse lampe sur place ou plateforme PCR en temps réel pour les champs d’entrée correspondantes de la demande de validation. Le résultat de la validation s’affiche immédiatement après avoir entré les données.

Representative Results

Lors de la validation de l’essai de b. tabaci lampe, interceptés au cours du processus de contrôle régulier Swiss import des spécimens d’insectes ont été analysées8. Les spécimens provenaient de huit pays différents (îles Canaries, République dominicaine, Israël, Malaisie, Maroc, Singapour, Thaïlande et Vietnam) et reflètent la diversité génétique de b. tabaci à POEs européen8. Tous les résultats de la lampe étaient une validation croisée par DNA barcoding8. Sur un total de 80 spécimens analysés par lampe, 75 spécimens (93,8 %) ont été correctement identifiés comme b. tabaci (true-positifs), deux spécimens (2,5 %) ont été correctement identifiées comme n’étant ne pas b. tabaci (true-négatifs) et trois spécimens (3,8 %) ont été identifiés à tort comme n’étant ne pas b. tabaci (faux-négatifs) (tableau 2)8. Les résultats négatifs corriger provenaient de deux spécimens de Trialeurodes vaporariorum , une espèce non réglementés à haut risque d’être confondue avec b. tabaci dans les PDE pour plantes produits8. Selon ces résultats, les mesures suivantes de précision diagnostique ont été calculés : tester la spécificité (taux de vrai négatif), 100 % ; tester la sensibilité (taux de true-positifs), 96,2 % ; tester l’efficacité (pourcentage de résultats corrects), 96,3 % (tableau 2)8. Lorsqu’on évalue la sensibilité analytique (limite de détection), le dosage de b. tabaci lampe avec succès échantillon ADN amplifié dilué à 100 fg/µL à travers trois répétitions techniques (tableau 3). Un sous-ensemble des essais (N = 13) s’est déroulée dans des conditions à l’aéroport de Zurich Suisse POE sur place par les inspecteurs de la santé végétale à l’aide du prêt-à-utiliser b. tabaci lampe kits8. Lorsqu’une validation croisée dans le laboratoire de référence, tous les résultats des essais sur place ont été jugées correctes (tester l’efficacité = 100 %)8. Évaluer les performances du test lampe sur place, le temps moyen à positive (temps jusqu’à ce que des résultats positifs n’était disponible) était 38,4 ± 10,3 min (moyenne ± écart-type)8. Une parcelle d’amplification ADN représentatif et le recuit dérivé d’une analyse de b. tabaci lampe réalisée dans des conditions sur place sont indiquées dans la Figure 3 a et B. Dans cet exemple, les exemples un et deux ont été correctement identifiés comme b. tabaci indiquée par amplification de l’ADN après environ 30 min (Figure 3 a) ainsi que la température de recuit attendue à environ 82 ° C (Figure 3 b). Figure 1 : visualisation de la mise en place expérimentale d’un prêt-à-utiliser le kit de lampe de b. tabaci décrites dans le protocole. S1, exemple 1 ; S2, exemple 2 ; PAC, contrôle d’amplification positive ; ANC, contrôle négatif d’amplification. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : schéma de validation lampe lecture. PAC : contrôle amplification positive ; Du CNA : contrôle d’amplification négatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : dérivé de tracé (A) et de recuit d’amplification ADN (B) d’une analyse de b. tabaci lampe réalisées dans des conditions sur le site. Fluorescence est mesurée en unités d’intensité relative. Ligne verte, exemple 1 ; ligne orange, exemple 2 ; ligne bleue, contrôle négatif d’amplification (NAC) ; ligne rouge, témoin d’amplification positive (PAC). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Composant Stock conc. La réaction finale conc. Volume par réaction Taq polymérase Master Mix x 2 1 x 10 ΜL Apprêt C1-J-2195 20 ΜM 0,4 ΜM 0,4 ΜL Apprêt TL2-N-3014 20 ΜM 0,4 ΜM 0,4 ΜL Eau de qualité moléculaire – – 8.2 ΜL Matrice d’ADN – – 1 ΜL Tableau 1 : préparation de mastermix réaction PCR pour le B. tabaci contrôle d’amplification positive. Les composants et les concentrations nécessaires pour mettre en place une réaction de PCR. Le volume réactionnel final est 20 µL. séquences d’amorces sont indiquées en 1.2.1.1. N NTP NFP NTN NFN SEN (%) SPE (%) EFF (%) 80 75 0 2 3 96,2 100 96.3 Tableau 2 : Résultats de la B. tabaci Validation de test lampe. N, nombre d’analyses ; NTP, nombre de vrai positifs ; NFP, nombre de résultats faussement positifs ; NTN, nombre de résultats vrai négatif ; NFN, nombre de résultats faussement négatifs ; SEN, sensibilité diagnostique ; SPE, spécificité diagnostique, FEP, tester l’efficacité. CADN (fg/µL) NPR TP (min)(moyenne ± écart-type) TA (° C)(moyenne ± écart-type) 1 x 105 3 33,5 ± 2,9 81,3 ± 0,1 1 x 104 3 30,7 ± 1,1 ± 81 0,0 1 x 103 3 40,4 ± 3,9 81,1 ± 0,1 1 x 102 3 50.7 ± 1,6 81,1 ±0, 1 1 x 101 0 – – 1 x 100 0 – – Tableau 3 : sensibilité analytique (limite de détection) de la B. tabaci test lampe. Chaque dilution a été testée en géométrie. CADN, teneur en ADN par la réaction ; NPR, nombre de résultats positifs réplicats ; TP, jusqu’à ce qu’un résultat positif était disponible ; TA, recuit de température ; SD, écart-type.

Discussion

La capacité d’identifier avec précision les organismes potentiellement nuisibles sans délai représente un aspect crucial de la gestion des espèces de ravageurs pour9,10,26. En plus d’être rapide, pour les produits d’importation de végétaux, une méthode d’identification de parasites idéal devrait être simple à effectuer sur place à POEs8,26. Cet article décrit le protocole d’un nouveau dosage de lampe pour l’identification rapide de b. tabaci, un organisme de quarantaine insectes souvent intercepté aux frontières de l’Europe (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-rapport _2016.pdf).

La raison d’être au point le test diagnostique a été de concevoir un protocole facile à suivre qui peut être effectué au cours de la procédure de contrôle d’importation végétaux par les inspecteurs de la santé végétale avec une formation minimale de laboratoire. Afin de rendre sur le site test aussi rapide et simple que possible, le protocole est divisé en deux parties : la préparation d’un kit prêt à l’emploi et le rendement réel de l’essai de la lampe. La première partie pourra être effectuée dans un laboratoire externe pour que l’inspecteur de la santé végétale puisse effectuer l’extraction d’ADN et test de la lampe sur place avec seulement une étape de pipetage.

Mais qu’une seule étape, pipetage de petites quantités de liquide peuvent être difficiles pour les utilisateurs ayant peu ou aucune expérience en laboratoire. Pour résoudre ce problème, un colorant (rouge de crésol) est ajouté à la solution d’extraction afin que l’opérateur peut confirmer visuellement que la petite quantité (c.-à-d. 2,5 µL) de l’ADN est correctement transférée au tube respectif. Une autre importante simplification du protocole est l’application de validation qu’il facilite une interprétation fiable de l’affichage de la lampe (fichier supplémentaires 1).

Le roman de b. tabaci dosage de lampe a été validé dans des conditions sur place et laboratoire en testant des spécimens d’insectes ont intercepté au cours du processus de contrôle d’importation régulière de Suisse8. Au total, 80 spécimens provenant de trois continents, Afrique, Eurasie et Amérique du Nord, ont été analysés par lampe. Parmi les 80 spécimens, seulement trois (3,8 %) étaient à tort identifiées (faux-négatifs)8. Lorsqu’on analyse les séquences d’ADN cible amorce les spécimens de faux négatifs, il a été constaté qu’ils étaient de nouveau haplotypes de b. tabaci qui n’ont jusqu’à présent pas été décrits8. Selon ces résultats, les amorces de b. tabaci lampe a été modifiée et avec succès re-validé8.

Une limitation majeure de n’importe quelle méthode d’axée sur l’amplification d’ADN y compris lampe est qu’ils identifient seulement prédéfini cible ADN séquences8,27. Une connaissance approfondie de la variation génétique trouvée dans la séquence cible de l’apprêt est donc essentielle d’assurer la précision diagnostique8,27. Cependant, cette information est souvent très limitée, surtout dans le cas de nouvelles espèces de ravageurs8. Bien que rare, causées par des mutations dans la séquence cible des résultats faussement négatifs sont attendus8. Dans le cas de l’essai de b. tabaci lampe présent, une solution pour ce problème est la combinaison avec une DNA barcoding technologie, une stratégie qui s’est rendu compte dans le cadre de la mise en œuvre de ce test de diagnostic à l’ aéroport de Zurich POE8. Ici, tous les résultats de lampe négatifs ont été ré-analysés par DNA barcoding dans un laboratoire externe8. Dans le cas où un haplotype de nouveaux ravageurs non encore décrit est rencontré, les amorces de lampe peuvent être modifiés à l’aide de la séquence d’ADN générée dans le processus de codage à barres8. Ainsi, la perte de vitesse dans le cas d’un résultat négatif de la lampe est compensée la précision diagnostique maximale assurée dans ce processus en deux étapes8.

Les coûts d’investissement pour le dosage de lampe actuel à un POE sont environ USD 25 000. Avec le nombre croissant de lampe tests mis au point pour les organismes nuisibles aux végétaux (par exemple, Erwinia amylovora, Flavescence dorée et Guignardia citricarpa), un tel investissement ponctuel apparaît justifiée13,15, 28. Toutefois, le protocole pourrait potentiellement être modifié pour réduire ces coûts encore plus loin. Par exemple, pour l’extraction de l’ADN étape à 95 ° C, le mitigeur thermo utilisé ici pourrait être remplacé par un bain d’eau moins cher, ou en effectuant cette étape directement dans le dispositif de lampe en temps réel. En outre, les étapes de mélange sur le vortex pourraient probablement être remplacés par pichenette manuellement les tubes, et lors de l’étape de transfert d’ADN la multipipette pourrait être remplacée par inoculation stérile boucles.

Les améliorations futures pour une identification rapide des espèces b. tabaci et ravageur en général pourraient être une implémentation d’une méthode de séquençage sur place qui permettrait d’effectuer des analyses de codes à barres d’ADN dans les PDE. Un système de candidats prometteurs pour une telle application est la technologie de séquençage nanopore. En effet, la technologie a récemment été implantée avec succès dans un effort de codage à barres ADN sur place pour évaluer la biodiversité d’une forêt tropicale8,29,30. Un système d’identification sur le site DNA barcoding peut remplacer complètement la nécessité pour le développement de tests diagnostiques ciblées et leur validation. Aussi il permet de recueillir des informations supplémentaires sur les caractéristiques de ravageurs tels que les pesticides résistance gènes8. Néanmoins, jusqu’à ce que les technologies de séquençage roman s’appliquera systématiquement, le dosage de lampe de b. tabaci représente un rapide (< 1 h) et la méthode d’identification précise.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs sont reconnaissants à Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun et Sven Moeller pour avoir participé à la validation du test lampe b. tabaci .

Materials

B. tabaci LAMP primer mix OptiGene Ltd. on request For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Centrifuge MiniSpin Eppendorf AG 5452000010 For several centrifugation steps
Cresol red (red dye) Sigma-Aldrich Corp. 114472 Component of
DNA extraction solution
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf AG 5382000015 For DNA extraction
Genie II (on-site LAMP analysis device) OptiGene Ltd. Genie® II For LAMP analysis
Genie Strips (8-tube LAMP strips) OptiGene Ltd. OP-0008-50 For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
HotStarTaq Master Mix Qiagen AG 203443 For generation of positive
amplification control
Labcycler (Thermocycler) SensoQuest GmbH,
distributed by Witec AG		 011-103 For DNA extraction
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix OptiGene Ltd. ISO-001LNL For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Mini centrifuge Labnet Prism Labnet International Inc. C1801 For several centrifugation steps
NucleoFast 96 PCR Marcherey-Nagel GmbH 743500.4 For clean-up of positive
amplification control
Potassium hydroxide solution Sigma-Aldrich Corp. 319376 Component of
DNA extraction solution
Qbit Fluorometer 3 Thermo Fisher Scientific Corp. Q33226 For measuring DNA conentration
of positive control
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 For clean-up of positive
amplification control
Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) Eppendorf AG 0030 121.023 For DNA extraction
Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) Eppendorf AG 0030 120.094 For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Wood Toothpicks VWR International LLC 470226-594 For DNA extraction
Vortex-Genie 2 (Vortex) Scientific Industries Inc. SI-0236 For several mixing steps
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  2. Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
  3. Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
  4. Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
  5. Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
  6. Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
  7. Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
  8. Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
  9. Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
  10. Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
  11. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
  12. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
  13. Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
  14. Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
  15. Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
  16. Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
  17. Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
  18. Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
  19. Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
  20. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
  21. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. e. n. GenBank. Nucleic Acids Research. 33, D34-D38 (2005).
  23. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  24. Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
  25. Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
  26. Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
  27. Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
  28. Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
  29. Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
  30. Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).

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Blaser, S., Diem, H., von Felten, A., Gueuning, M., Andreou, M., Boonham, N., Tomlinson, J., Müller, P., Utzinger, J., Frey, B., Frey, J. E., Bühlmann, A. A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci. J. Vis. Exp. (140), e58502, doi:10.3791/58502 (2018).
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