Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

Les expériences décrites ici ont été réalisées à l’aide de 6 à 8 semaines, anciennes souris de type sauvage (C57BL6/J), maintenus dans une usine (SPF) exempte de pathogènes spécifiques. Toutes les expériences animales ont été approuvées par College London le Kings et le bien-être des animaux Institut Francis Crick et organe d’examen éthique, le Home Office du Royaume-Uni. Avant de commencer toute procédure d’animaux, assurez-vous que les autorisations appropriées sont obtenues par le biais de l’institution/organisation locale. 1. l’administration d’antibiotiques Remarque : Deux méthodes possibles pour un traitement antibiotique sont fournis : gavage oral (étape 1.1) et l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable (étape 1.2). Gavage oral Préparer des stocks d’antibiotiques individuels en les dissolvant dans l’eau stérilisés à l’autoclave pour les concentrations suivantes : ampicilline à 100 mg/mL, gentamicine à 100 mg/mL, néomycine à 100 mg/mL, métronidazole à 10 mg/mL et la vancomycine à 100 mg/mL. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Aliquote et conserver à-20 ° C. Préparer un cocktail d’antibiotiques en mélangeant les stocks établis ci-dessus. Pour un volume de 1 mL, mélanger 50 µL d’ampicilline (5 mg/mL en finale), 50 µL de gentamicine (5 mg/mL finale), 50 µL de néomycine (5 mg/mL final), 500 µL de métronidazole (5 mg/mL final), 25 µL de vancomycine (2,5 mg/mL final) et 325 µL d’eau. Préparer le cocktail frais avant utilisation. Charger le mélange antibiotique dans une seringue stérile 1 mL et fixer une aiguille de gavage de calibre approprié (20 G pour souris de 15 à 20 g) tout en éliminant les bulles. Souris de gavage avec 200 µL du mélange aux antibiotiques. Prenez la peau par-dessus l’épaule de souris fermement, étirer la tête et du cou pour redresser le œsophage. Dirigez la boule-la pointe de l’aiguille alimentation le long du toit de la bouche et vers l’arrière du pharynx. Puis, doucement, passez-la vers le bas dans le œsophage et injecter la solution 200 μL. Administrer les antibiotiques autrefois cocktail tous les jours pendant la durée de l’expérience. Antibiotiques dans l’eau potableATTENTION : Surveiller attentivement le poids de la souris par jour pour les deux premières semaines de l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable. Préparer un cocktail d’antibiotiques en dissolvant le suit dans 1 L d’eau stérilisés à l’autoclave : 1 g d’ampicilline (1 g/L final), 1 g de néomycine (1 g/L final), 1 g de métronidazole (1 g/L final), 0,5 g de vancomycine (0,5 g/L final) et 8 sachets (0,75 g chacun) d’artificiel édulcorant (60 g/L final). Agiter jusqu’à dissolution. Conserver à 4 ° C.NOTE : Édulcorant est ajouté pour masquer la saveur des antibiotiques et de prévenir la déshydratation de la souris. Alors que plusieurs marques édulcorant peuvent fonctionner, la concentration finale requise peut être différente pour chaque marque spécifique. Verser le cocktail aux antibiotiques dans une bouteille d’eau (~ 100 mL/bouteille) et placer le flacon sur une cage de la souris.Remarque : Utilisez des bouteilles brunes ou couvrir les bouteilles avec une feuille pour protéger les antibiotiques contre la lumière. Remplacer le cocktail antibiotique avec stock frais deux fois par semaine pendant la durée de l’expérience. 2. la collecte d’échantillons de matières fécales de selles, le contenu de l’iléon et iléon mur Peser et identifier 2 mL tubes stérilisés à l’autoclave pour prélèvement d’échantillons. Pour la collecte d’échantillons de selles fraîches, placez chaque souris dans une drisse et recueillir les pelotes fécales directement de l’anus dans un tube de prélèvement.NOTE : Échantillons peuvent également être obtenus en plaçant la souris dans une cage propre autoclavée et le prélèvement d’échantillons de selles avec une pince stérile propre. Euthanasier les souris avec CO2 asphyxie suivie par dislocation cervicale. Posez une carcasse de souris avec l’abdomen entièrement exposé et pulvériser la région abdominale avec l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux et pinces stérilisées, pratiquer une incision transversale dans l’abdomen pour exposer le péritoine sans endommager les tissus internes. Soulevez le péritoine et pratiquer une incision pour exposer les intestins. Retirez les intestins (du côlon vers l’estomac) avec les pinces et ciseaux et placez-le dans une boîte de Petri stérile. Utilisez soigneusement pinces pour taquiner l’intestin grêle (SI) loin des artères mésentériques et du gras. Étendre l’intestin et le placer sur un chiffon propre laboratoire. Avec une règle, mesurez et coupez 4 cm de l’iléon distal de l’is (la partie la plus proche pour le caecum). Couper et jeter les 1 cm de l’intestin proximal au caecum. Il y aura une partie de 3 cm d’iléon à gauche qui sera utilisé pour recueillir les bactéries intestinales. Placez la partie de l’iléon (3 cm) sur un tube stérile de 2 mL. Recueillir le contenu intestinal en extrudant directement l’intestin et rassemblions l’échantillon dans le tube. Cet exemple aura des bactéries présentes dans le contenu de l’iléon. Préparer une seringue de 20 mL avec du sérum physiologique froid tamponnée au phosphate (PBS), puis rincez la partie de l’iléon (jeter le cheminement). Placer la partie de l’iléon sur une serviette en papier propre et ouvrez-le longitudinalement avec des ciseaux. Gratter l’intérieur de la paroi de l’iléon avec un scalpel. Collecter toutes les bactéries sur le scalpel en lavant le scalpel avec 1 mL de PBS dans un tube à centrifuger propre. Tourner à 8 000 × g pendant 5 min pour les bactéries de granule et éliminer le surnageant. Cet exemple contient des bactéries provenant de la paroi de l’iléon.Remarque : Des échantillons de selles, le contenu de l’iléon et mur peuvent être congelées et conservées à-80 ° C jusqu’à l’utilisation. Peser les tubes contenant les échantillons de selles et l’iléon contenu et de soustraire le poids des tubes vides (à l’étape 2.1) pour obtenir le poids fécal dans chaque échantillon. Extraire l’ADN bactérien de selles, de contenu de l’iléon et d’iléon mur échantillons utilisant des kits disponibles dans le commerce. Conserver les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu’à l’utilisation. 3. quantification du microbiote Intestinal de qPCR Remarque : Cette procédure inclut la génération d’une norme (étape 3.1) et la méthode de mise en place de qPCR pour les échantillons les et standards (étape 3.2) Génération d’une norme pour qPCR Réaction en chaîne par polymérase (PCR) permet d’amplifier le gène de l’ARNr 16 s de l’ADN génomique extrait d’une culture bactérienne en utilisant les réactifs13 et les conditions PCR détaillés dans le tableau 1. Exécuter le produit PCR sur un gel d’agarose de 1,5 % et purifier la bande d’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce. Ligaturer le purifiée fragment d’ADN utilisant un clonage kit (voir la Table des matières, utilisez un vecteur contenant les marqueurs de résistance aux antibiotiques et fusion de gènes β-galactosidase (LacZ) pour la sélection de la colonie de bleu/blanc) et transformer DH10 compétente E. coli suivant les instructions du fabricant. Plaque de transformation sur l’ampicilline (100 µg/mL), des plaques de gélose Luria Bertani (LB) X-gal (20 µg/mL) (10 g/L Tryptone, 5 g/L, extrait de levure, 10 g/L de NaCl, 15 g/L Agar). Incuber pendant la nuit (O/N) à 37 ° C. Choisir une colonie seul positifs (blanc) de la plaque. Il inoculer dans 5 mL de bouillon de LB contenant 100 µg/mL d’ampicilline et incuber O/N à 37 ° C, agitation à 250 tr/min. De la culture O/N, isoler et purifier le plasmide à l’aide d’une trousse commerciale miniprep conformément aux instructions du fabricant.Remarque : Il est important de la séquence de l’insert de plasmide à ce stade, pour s’assurer que le plasmide ne contienne qu’une seule copie du gène de l’ARNr 16 s et déterminer sa longueur en paires de bases (bp). Linéariser le plasmide avec une enzyme de restriction qui coupe le plasmide qu’une seule fois. Purifier le plasmide linéarisé à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Déterminer la concentration du plasmide par mesurer l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Calculer le nombre de copies de plasmide/µL de l’échantillon à l’aide de la formule suivante14:nombre d’exemplaires = (quantité * 6.022 × 1023) / (longueur * 1 × 109 * 650)Lorsque le montant est la concentration d’ADN obtenue à l’étape 3.1.8 (en ng/µL) ; et la longueur est la longueur totale du plasmide (avec l’insert) dans bp. Le nombre d’exemplaires sera obtenue comme copies/µL.Remarque : Il existe des outils en ligne basés sur la formule ci-dessus qui permettent le calcul simple du nombre de copies de plasmide. Aliquote et magasin la norme au besoin à-20 ° C jusqu’à l’utilisation. qPCR Set-up pour Standard et des échantillons de matières fécales Décongeler le qPCR standard (de l’étape 3.1.10), les échantillons de matières fécales ADN (de l’étape 2.15) et les réactifs de qPCR (partir d’un kit disponible dans le commerce) sur la glace.Remarque : qPCR réactifs utilisés dans cet exemple comprennent le mélange de réaction de qPCR SYBR Green et les amorces et inverses (tableau 2). Diluer la norme dans l’eau stérile sans ADN dans une gamme de 107 à 102 copies/µL (p. ex., 1/5 des dilutions de 107 à 6,4 x 102 copies/µL). Diluer les échantillons fécaux ADN à 1/2, 1/5, 1/10. Faire une réaction mélange principal pour le nombre total de réactions plus 1 (tableau 2). Mix 30 µL du mélange maître et 5 µL de modèle (standard, échantillon ou eau pour contrôle négatif) Ajouter 10 µL de ce mélange dans chaque puits dans une plaque 384 puits optique qPCR. Effectuer chaque réaction en trois exemplaires. Sceller l’endroit qPCR, centrifuger brièvement et charger la plaque sur la machine de qPCR programmée dans les conditions suivantes de cyclisme : 95 ° C pendant 20 min suivi de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min. Obtenir les valeurs de CT pour standard et échantillons. Générer une courbe d’étalonnage en traçant les valeurs de CT pour les normes contre le logarithme du nombre copie du plasmide (tel que calculé à l’étape 3.1.9). Effectuer une régression linéaire de la courbe standard. Calculer le nombre de copies des ADNr 16 s pour les échantillons de matières fécales en interpolant les valeurs de CT (obtenus à l’étape 3.2.2) dans la courbe d’étalonnage.NOTE : nombre de copies ADNr 16 s pour chaque échantillon doit être corrigé en tenant compte du facteur de dilution de l’échantillon (tel qu’établi à l’étape 3.2.2), les volume final des acides nucléiques qui sont éluées (à l’étape 2.15) et la quantité d’échantillon fécal (calculée en étape 2.14) pour obtenir copies du gène par gramme de fèces.