Burada, biyolojik ve biyomedikal çalışmalarda 3D akciğer doku kültürleri modeli insan akciğer hastalıkları için oluşturmak için uygun özel dolu insan hassas kesim akciğer dilimleri rezeke hasta dokusundan hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut.
Çeviri insan hastalık için yeni keşifler insan doku tabanlı modeller hastalığının göre stok miktarı sınırlıdır. 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) zarif temsil gibi kullanılan hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS) ve biyolojik olarak son derece alakalı 3D hücre kültür modeli, son derece benzer biyomekanik kendi karmaşıklığı nedeniyle yerinde doku ve moleküler kompozisyon. Doku Dilimleme çeşitli hayvan modellerinde yaygın olarak uygulanır. 3D-LTCs insan PCLS elde edilen daha fazla mekanizmaları ve ilaçların insan dokusu içinde işlevsel etkileri daha iyi anlamak için yardımcı olabilir roman ilaçlara yanıt-e doğru çözümlemek için kullanılabilir. PCLS hazırlık cerrahi olarak rezeke akciğer doku örneklerinden akciğer lobektomi deneyimli, hastaların, peritumoral doku ve hastalıklı erişilebilirliğini artırır. Burada, biz insan PCLS cerrahi olarak rezeke yumuşak-elastik hasta akciğer dokusundan nesil için detaylı bir protokol tanımlamak. Özel resectates bronchoalveolar uzaya böylece akciğer yapısını koruyarak ve sonraki Dilimleme için çok önemlidir doku’nın sertliği artan kullanılmaya başlandı. 500 µm kalın dilim doku Block bir vibratome ile hazırlanmıştır. PCLS alınan biyopsi delikler karşılaştırılabilir doku örneklerin boyutu sağlamak ve daha fazla doku örneği miktarını artırmak. Oluşturulan akciğer doku kültürleri patofizyolojisi ve mekanizmaları, onun en iyi yönü (alt-) hücresel düzeyde fibrotik işlemler gibi farklı hastalıkların da dahil olmak üzere insan akciğer biyoloji çalışmalarda çeşitli uygulanabilir. 3D-LTC ex vivo modeli yüksek yararına in situ durumdaki insan akciğer 3D doku mimarisi, hücre türü çeşitlilik ve akciğer anatomisi yanı sıra doku bireysel hastaların değerlendirilmesi için potansiyel bakımından yakın onun temsilidir hangi daha fazla hassas tıp için yeni stratejiler geliştirmek uygundur.
Kronik ve akut akciğer hastalıkları morbidite ve mortalite dünya çapında1önemli bir nedenidir. Obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH)2, şiddetli astım3, akciğer kanseri4 ve diffüz parenkima akciğer hastalıkları5gibi kronik akciğer hastalığı olan hastalar için iyileştirici tedaviler Şu anda kullanılabilir değil. Akciğer hastalıkları için hayvan modellerinde çalışmalar hastalık pathomechanisms6 anlayış derinleştirdi ve potansiyel yeni tedavi hedefleri7,8,9tanımlaması açmıştır olsa da, Bu modeller zaman insanlar10‘ a göre ilgili biyolojik ve fizyolojik farklılıklar sergilerler. Fare ve insan biyolojisi hem de anatomi, ex vivo 3D akciğer doku kültürü insan arasındaki bu farklılıkları aşmak için (3D-LTC) sistemleri Biyomedikal araştırma çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Bu 3D-LTC kültür sistemleri hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS) temel alır. PCLS üretimi ex vivo kayma ve işlevsel ilişkiler tüm alveoller ve airways11, hem de interstitium, damarlara hücrelerinin incelenmesi için izin veren bir üçüncü kayma dimensionality analiz sağlar ve Mesothelium. Özellikle, PCLS ex vivo modelleri in situ olarak akciğer en işlevsel hücreleri içeren anlamına gelir, böylece yakından hücre yerel biyolojik ortamını temsil eden ve böylece sınırlı hücre-hücre ve hücre-matris etkileşim çoğu 2D üstesinden çok hücreli, hücre kültürü yaklaşıyor. Şu ana kadar ex vivo fare PCLS KOAH12, akciğer fibrozis13, akciğer kanseri14, viral enfeksiyon15,16, bronkopulmoner displazi17, gibi göğüs hastalıkları modellemek için kullanılan ve astım18. Ancak, yeni ilaç tedavileri insan akciğer hastalıklarında klinik deneylere araştırıldı hatırı sayılır bir oranda değil çevirmek için klinik etkinliği veya Emanet, onların eksikliği nedeniyle assumingly nedeniyle henüz insan arasında önemli farklılıklar ve fare biyoloji hastalığı19,20,ve21.
Birkaç yıl içinde insan PCLS büyük ölçüde ilaç ve kimyasallar akciğer toksisitesi değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak son zamanlarda, insan akciğer doku KOAH22,23, astım24ve akciğer fibrozis25, hastalardan patofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar takip kullanılmaya başlanmıştır. Tarafından rezeke hasta organ malzeme kullanarak ve PCLS üreten, bir büyük hastalık işaretlerinden temsil eden ve yerel hücresel çeşitlilik organ çoğunu bakımı bir karmaşık 3D doku çevre22 özetlemek. Ayrıca, çeşitli deneysel kurulumları uygulanan hastalıklı doku26,27,28,29karaciğer, bağırsak ve böbrek hastalığı gibi değişiklikler taklit etmek için gösterildi.
Ancak, akciğer dokusunun işleme çeşitli nedenlerden dolayı zor kalır. Sağlam doku, aksine yerel akciğer parankimi havalandırma daraltmak eğilimindedir ve daha düşük doku sertlik sergiler. Bu özellikler doku Dilimleme engel. Bu nedenle, havayolları ve düşük erime noktası özel alveoler boşlukla dolgu yerli akciğer yapısını korur ve fare ve insan akciğerleri30/ hassas kesme Dilimleme için gerekli sertliği sağlar. Araştırma amaçlı hibe insan akciğer resectates anatomik olarak, genetik ve fizyolojik açıdan son derece çeşitli, böylece sık sık yüksek arası hasta değişkenlik deneyler25gerçekleştirirken sunan onların doğası gereği vardır. Tüm lob veya tüm akciğer explants aksine, akciğer örnekleri aracılığıyla göğüs cerrahisi rezeke ille anatomik kesimleri izleyin ve, bu nedenle, özel bir hazırlık gerektirir. Bu makalede, insan PCLS rezeke akciğer dokusu ve onların sonraki ekimi ve deneysel kullanım modeli akciğer hastalığı için nesil için detaylı ve en iyi duruma getirilmiş bir protokol sağlar.
Bu el yazması açıklanan protokol PCLS nesilden insan akciğer doku resectates sıvı özel ve sonraki vibratome Dilimleme ile doldurarak kapsar. Oysa bu organların doğasında sertliği doku herhangi bir değişiklik olmadan Dilimleme doğrudan izin dokusu dilimlerin nesil önce organlar, karaciğer ve beyin, gibi birkaç gösterilmiştir. Belirtmek gerekirse akciğer dokusunun ilk uygun hazırlık PCLS üreten en önemli adımdır. Özel dolgu akciğerin yönteminin seçimi, yumuşak ve esnek doğası stabilize etmek ve homojen ve tekrarlanabilir PCLS üretimi sağlamak için var. Büyük havayolları rezeke akciğer dokusu bozulmamış akciğer parankimi yanı sıra küçük airways erişim sağlamak için cannulated. Özel doldurma neredeyse imkansız hale getiriyor, sağlam bir plevra eksikliği neden akciğer doku akciğer Dilimleme için kullanışlı değildir çoğunlukla önemli bir nedendir. Prospektif, ilk olarak fonksiyonel deneyler decellularized iskele üzerinde gerçekleştirmek için tasarlanmış bir sentetik plevra başarılı özel dolgu bir bozulmamış plevra31eksikliği explants ulaşmak için potansiyel olarak uygulanabilir. Bir insan akciğer doku parçası olduğu gibi plevra ile sonuçlanan rezeksiyonu Dilimleme için doku blok oluşturmak için gereklidir. Rezeke doku daha tümör-Alerjik dokudan kanser rezeksiyonu nedeniyle tamamen bozulmamış loblar veya bütün akciğer explants akciğer nakli yapılan hastaların kullanılabilir.
Genellikle, iki sistem PCLS üretmek için kullanılır: Krumdieck doku dilimleyici15 ve titreşimli microtomes (vibratomes). Doku Dilimleyiciler PCLS 90 ° bu gemi sonunda keser bir metal damar yoluyla bir doku blok geçirerek dilimler oluşturur. Vibratomes oluşturmak PCLS bir titreşimli taşıyarak bıçak Krumdieck dilimleyiciye karşılaştırıldığında soğutmalı bir orta banyoda batık doku bağlantılı bir blok üzerinde yatay olarak giderek artan doku daha az kesme gücü. Bu ekimi önce dokusunun daha az sert tedavi olur. Öte yandan, vibratome kesme daha fazla zaman ve iş alıcı olduğunu. Elimizde, maksimum 100 PCLS veya 500 PCLS üretimini etkin Dilimleme vibratome bir günde, en deneysel çalışmalar için yeterli yumruk atıyor. PCLS çeşitli şekillerde kültürlü: (a) Trans-wells için böylece bir hava sıvı arabirim oluşturma, (ALI) sistemi, dinamik organ Kültür (DOC) (b) olarak bağlı, veya (c) hücre kültür orta standart hücre kültür koşulları, sular altında. Yukarıda açıklanan22,23,25PCLS ayrıntı ekimi yapıldı; Ancak, bunların kullanım dünyanın her yerinden çeşitli Labs’de arasında yetiştirme koşulları ortak bir standart yok. Özellikle, kültür zaman kritik olabilir: fare PCLS olduğu gibi SFTPC olumlu alveoler tip 2 hücrelerinin kaybı 144 h sonra ama 120 h22sonra görülmektedir. Buna ek olarak, metabolik aktivite fare22 ve insan PCLS25 120 h için kalır kararlı gibi görünüyor.
PCLS üretimi için birkaç teknik sınırlamaları vardır: resectates boyutunu ve sayısını değişiklik gösterir zaman içinde; alınan doku içinde olduğu gibi plevra varlığını bağlıdır, özel doldurma, verimliliğini PCLS üretimi son başarısını belirler; ve elde edilen (hastalıklı) akciğer dokusu içinde patolojik değişiklikler neden doku yıkımı PCLS hazırlık ile etkileşebilir. Hava yolu tıkanıklıkları ve fibrotik doku sağlam alveoler alanı eksik özel doldurma engel ve böylece fibrotik doku zorlu bir görev Dilimleme olun. KOAH veya Alfa-1-anti-tripsin eksikliği değil dayanabilir doldurma özel baskısı ve kopma alveoller ve mimari eserler yol açacak gibi hastalıklarda emphysematous doku olarak buldum. Bu gibi durumlarda, örneğin, %1 (w/v), düşük özel konsantrasyon kullanımı özel doldurma sırasında hız ve basıncı azaltmak yararlı olabilir. Genel olarak, doku hastalığı durumunu önemli ölçüde PCLS üretimi için doku kullanımını sınırlayabilirsiniz. Bu parametreler akciğer dokusundan üretilen PCLS miktarını belirlemek ve aynı zamanda bu PCLS üretmek için gereken süre. Ayrıca PCLS sınırlamaları daha fazla deneyler için normalleştirme adımları gerektirir boyutu veya doku içerik ile ilgili olarak farklı akciğer dilimleri arasında tutarsızlıklar vardır. Bu sorunu gidermek için aynı dilim benzer bölgelerinde biyopsi yumruklardan oluşturulabilir. Bu yordamı doku değişkenliği azaltmak ve ek bir yararı, deneyler için kullanılan PCLS örneklerin sayısını artırmak, apt.
Sonuç olarak, insan 3D akciğer doku kültürleri özel PCLS dolu akciğer fizyolojisi ve Hastalıkları Eğitim için karmaşık bir insan modeli sağlar. Protokol PCLS hazırlık rezeke akciğer dokusu ve onların ekimi ayrıntılı bir açıklamasını sağlar ve ayrıca özel doldurma insan Akciğer rezeksiyonu ve nasıl bunların üstesinden içinde sorunlarını ele alır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Marisa Neumann için uzman teknik yardım için minnettarız. Tüm akciğer dokusu TBM-M biyo-Arşiv tarafından sağlanan lütfen. Bu eser akciğer araştırma (DZL), Helmholtz Derneği ve TBM araştırma okul hibe Almanca Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |