受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析
Summary
ここでは、co 免疫沈降法及び酵素採用し酵素活性細胞膜受容体の特定のタンパク質ドメインの貢献を同時に勉強するビーズの酵素活性測定のためのプロトコルを提案する.
Abstract
受容器準の酵素は、細胞活性の主要な仲介人です。これらの酵素によって規制されて、少なくとも部分では、受容体の細胞質尾の物理的な相互作用。相互作用はしばしば特定の蛋白質のドメインを介して発生して酵素の活性化に 。タンパク質間相互作用を検討するいくつかの方法があります。Co 免疫沈降一般的に蛋白質蛋白質の相互作用に必要なドメインの研究に使われるがない試金同時に募集された酵素の活動に特定のドメインの寄与文書。したがって、ここで説明する方法は、co 免疫沈降法及び相互作用タンパク質と関連酵素活性の同時測定のためのビードの酵素活性アッセイを組み合わせたものです。このプロトコルの目的は、タンパク質と酵素の酵素の完全な活性化のための義務になっているドメインとの物理的相互作用にとって重要なドメインを識別するためにです。この試金の重要性を実証、他のドメインが同じ酵素の機能を調節する必要の酵素、受容体の細胞質テールへのバインディングにタンパク質ドメイン特定の受容体として貢献。
Introduction
触媒受容体と受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンドの結合が細胞内の側面1に酵素活性を引き起こす膜貫通蛋白質です。いくつかの受容体キナーゼや細胞質尾にホスファターゼなど特定の酵素を採用他、受容体と酵素の機能の両方を所有しています。受容体の尾とこの酵素の後続の触媒作用する酵素の募集は、同じタンパク質ドメイン2によって常に規制されていない、2 つの独立したプロセスです。残念ながら、同時に相互作用と酵素活性の両方を評価するために特定のツールはございません。ここで説明した機能 co 免疫沈降法ですその活性化から受容体の尾部に酵素の採用を分析する有用な方法です。この試金は、抗体をコートしたビーズでタグ受容体の免疫沈降を利用しています。その後、酵素活性アッセイとビーズの西部のしみの分析の両方が実行されます。タンパク質ドメインが受容体と酵素 (西部のしみの分析による評価) 間の相互作用の必要を明らかにするこのメソッドの全体的な目標は、どのドメインが (上ビーズを用いて酵素の完全な活性化のための義務酵素活性アッセイ)。ひと疾患の病態に関与による受容体酵素の別の関数を勉強するためのツールを開発する意義は大きい。また、さらにこれらの蛋白質の作用のメカニズムを理解することは、新しい治療的介入の設計を助けるかもしれない。
プログラムされた死-1 (PD-1) 表面 T 細胞の抑制性受容体であり過度の T 細胞の応答を制限するために必要です。近年、抗 PD 1 抗体は複数の悪性腫瘍1,2の治療に関与しています。PD 1 結紮は、増殖、接着、複数サイトカイン3,4、5の分泌など、多数の T 細胞機能を抑制します。PD 1 は免疫学のシナプスでは、T 細胞と抗原提示細胞の6日間、それは T 細胞受容体 (TCR)7colocalizes インターフェイスにローカライズされます。その後、チロシンホスファターゼ SHP2 [Src ホモロジー 2 (SH2) チロシン脱燐酸化酵素 2 を含むドメイン] PD 1、複雑な TCR とそれに関連付けられたキーのチロシン残基, 近位の dephosphorylation につながる細胞質テールを募集していますシグナリング分子3,4,5,8,9。PD 1 の細胞質テールには、2 つのチロシン モチーフ、細胞チロシン抑制モチーフ (ITIM) と細胞のチロシン基スイッチ モチーフ (ITSM)10が含まれています。両方のモチーフは PD 1 結紮9,10時にリン酸化します。部位特異的変異は、SHP2 PD 1 シグナリングとその機能の役割は不明、ITIM のではなく、募集4it サービスマネジメントの主な役割を明らかにしました。
SHP2 は、どちらか閉じた (折り返し) を採用、構造またはオープン (拡張) 活性コンフォメーション11禁じられます。PD 1 各テイル ドメイン SHP2 バインディングまたは活性化の貢献はまだ解明されていません。この質問に答える、PD 1 とその活動の12の尾に SHP2 の募集の並列テストを可能にするアッセイを開発しました。Co 免疫沈降法と並列で相互作用と酵素活性の両方をテストするビードのホスファターゼ活性の測定法を採用しました。この試金を使用して、PD 1 it サービスマネジメントが PD 1 ITIM が完全に拡張し、酵素を有効に必要ですが、PD 1 尾に SHP2 を募集するのに十分であることを示します。
いくつかの隣接するドメインは細胞質尾で多くの受容体があります。機能 co を免疫沈降法は、蛋白質の募集や酵素の活性化に必要な特定のドメインの役割を検出できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
受容体酵素の相互作用は、細胞内シグナル伝達のために重要です。多くの酵素は、SH2 ドメインの同じ受容体の尾を飾るリン酸化チロシンに結合受容体を募集しています。しかし、酵素は多くの場合、閉じるの使用頻度の低い構造に折り畳まし、活性化同じ受容体の他のドメインによって仲介することができます構造変化11が必要です。アッセイは、受容体、酵素、活動間の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、NIH の補助金 1R01AI125640-01 とリウマチ研究財団の資金を供給されました。
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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