Summary

疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

説明は、抗原のリポソーム化ナノ粒子と刺激的な B 細胞活性化の in vitroin vivoでの使用の準備です。一貫性と堅牢な抗体は、ピーナッツ アレルギーの新しいモデルの開発につながった。抗原性リポソームの生成のためのプロトコルは、異なる抗原と免疫モデルに拡張できます。

Abstract

抗体は病原体の広い配列に重要な防御免疫を提供します。ワクチン接種と同様どの病原性抗体反応をアレルギーと自己免疫疾患の開発の理解のための堅牢な抗体の生成に対する関心の高さが残っています。堅牢な抗原特異的抗体を生成する常に簡単ではありません。マウス モデルで多くの場合予防接種による抗体のレベルの変動の大きなにつながるアジュバントの複数のラウンドが必要です。一例は、マウス番号と補助の使用を最小限に抑えるより堅牢かつ再現性のあるモデルが有益であろうピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデルであります。ここで紹介はピーナッツ アレルギーのアナフィラキシーの再現性の高いマウス モデルです。この新しいモデルは、2 つのキーファクターに依存している: (1) 抗原特異的脾細胞が素朴な受信者マウス、マウスを用いての多数にわたって抗原特異的メモリー B および T 細胞数の正規化にピーナッツ感作マウスから転送に対して(2) の受信者のマウスはその後 (Ara h 2) 主要なピーナッツ アレルゲンを表示するリポソームの粒子の形で強力な多価免疫で昇圧され.このモデルの主な利点はその再現性、最終的にアジュバントの複数の注射を受けた動物の数を最小限に抑えながら、それぞれの研究で使用される動物の数が減ります。これらの免疫原性リポソームのモジュラー アセンブリは、病原性の抗体を含む他のアレルギーや自己免疫モデルに比較的安易な適応性を提供します。

Introduction

食物アレルギーは、アメリカ合衆国の子供の 8% に影響を与えるし、過去の有病率の増加している 10 年1。ピーナッツ アレルギーは、子供の 1% に影響を与える、通常小さくなった2ではありません。いくつかの有望な臨床試験が進行中である経口免疫療法 (OIT)、舌下免疫療法 (スリット)、皮膚免疫療法 (EPIT) など、食物アレルギーの治療のため現在はありません FDA 承認の治療戦略ピーナッツ アレルギーの個人3,4,5,6,7,8脱感作。そのため、アレルギーの個人は厳密にアナフィラキシーを回避するためにアレルゲンを避ける必要があります。多くの質問は、感作のルート、食品アレルギー疾患発症のメカニズムを基になるまま。

マウスのモデルは、新しい免疫寛容と脱感作療法9,1011,12の開発し同様、アレルギーのメカニズムを勉強のための貴重なツールです。これは特に、主要なピーナッツ アレルゲン (Ara h 2;Ah2) 人間にはまたいくつかの支配的なアレルゲン説明マウス モデル13,14。ピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデル、感作性と耐性のメカニズムの研究に貴重な欠点は、ことができます変数やアジュバントの使用が必要です。強力な混合は、このようなモデルの本質的な可変性を最小限に抑える 1 つの方法でしょう。B 細胞は強く、多価抗原によって活性化、アレルゲンを表示する抗原のリポソームが良いオプションも効率的のプロパティを持つ、B 細胞の受容器 (BCR) を介して B 細胞を有効に可能性があります機能のため抗原提示によって非具体的に取り上げられているから T 細胞コンパートメントをプライミング細胞。

ここでは、安易なモジュラー方式リポソームのナノ粒子への蛋白質の抗原の結合のための詳しいプロトコルについて述べる。サロゲート抗原、抗 igm 抗体 Fab フラグメントを使用して、ことを示すこのような抗原のリポソームが刺激的な B 細胞の活性化にすることができますどのように強力な。Ah2 抗原を表示する抗原のリポソームは、授与の感度の新しいマウスモデルの開発に使用されました。このモデルでピーナッツ固有のメモリ B と T-細胞を含む検証のピーナッツ アレルギー マウスの脾細胞は素朴なコンジェニック マウスに転送されます。Ah2 に対する抗体を誘導するために受信者のマウスに共役 Ah2 とリポソームの注入によるメモリ抗体が誘導されます。水溶性 Ah2 で 1 つだけのブーストによって続かれて、Ah2 特異的抗体を生じ強いアナフィラキシー反応これらのマウスはその後 Ah2 に立ち向かっているとき。このアプローチは、望ましいピーナッツ アレルギー モデルと成果に向けられた抗原によって駆動される他のマウスモデルのユーティリティがあると示唆しているアレルギー反応を受けているマウスが均一な方法で応答、アジュバントを受け取っていません。アレルゲンになり自己抗原。

Protocol

蛋白質に結合脂質とリポソームに組み込むことの一般的な方法は、以前の作業15主に基づいています。以下の動物のすべての手続きは、チャペルヒル機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ノースカロライナ大学で承認されています。ピーナッツ アレルギー モデルで使用されるすべてのマウスは、3 週齢から購入した BALB/cJ 女性です。アルバータ大学のアニマル ・ ケアおよ…

Representative Results

DSPE-PEG(2000) の興味の蛋白質の共役は、削減の増加を示す非蛋白質と比較して分子量を実行して示すことができます。図 1 aは、ペグ-DSPE、変性タンパク質の 2-3 kDa bandshift を示していますを抗マウス IgM F(ab) フラグメント活用の代表的なゲルを示しています。蛋白質の約 50% は、予想される 1:1 の化学量論は、重鎖および軽鎖の heterodimer です Fab 断片…

Discussion

ここで説明する方法は、タンパク質脂質リポソーム型ナノ粒子上で、蛋白質の表示を可能にするための一般的なプロトコルです。非常に大きい複合体タンパク質の場合は、このプロトコルにユーティリティを制限されています。理想的な方法は、使用する直交化学リンク戦略を可能にするサイト固有タグの導入でしょう。Recombinantly 蛋白質を表現する、市販されているペグインターフェロン?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国防総省 (W81XWH-16-1-0302 と W81XWH-16-1-0303) からの助成金によって支えられました。

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

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Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

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