نقدم هنا، البروتوكولات من أجل الاستفادة من الحشرات خلية باكولوفيروس البروتين التعبير النظام وإنتاج كميات كبيرة من البروتينات النباتية يفرز لبلورة البروتينات. لقد تم تعديل ناقل تعبير باكولوفيروس مع GP67 أو الببتيد إشارة هيمولين الحشرات للنبات التعبير إفراز البروتين في خلايا الحشرات.
لقد كان تحديا للعلماء للتعبير عن المؤتلف البروتينات حقيقية النواة الافرازية لدراسات هيكلية والبيوكيميائية. نظام التعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية واحدة من النظم المستخدمة للتعبير عن البروتينات الافرازية التوكسينات المؤتلف مع بعض التعديلات بوستترانسلاشونال. البروتينات الافرازية بحاجة إلى توجيه من خلال مسارات الافرازية للبروتين جليكوسيليشن وتشكيل روابط ثنائي كبريتيد وتعديلات أخرى بوستترانسلاشونال. لتحسين التعبير خلية الحشرات الموجودة من البروتينات النباتية الافرازية، يتم تعديل ناقل تعبير باكولوفيروس بإضافة أما GP67 أو إشارة هيمولين ببتيد تسلسل بين المروج ومواقع متعددة الاستنساخ. أنتجت هذا النظام الموجه المعدلة المصممة حديثا بنجاح عائد عالية من البروتينات مستقبلات النبات يفرز المؤتلف القابلة للذوبان من نبات التمويل. اثنين من البروتينات النباتية المعرب عنها، المجالات خارج الخلية من مستقبلات غشاء البلازما أعطيت تقرير التجارة والتنمية، و PRK3، وقد تبلور لدراسات الأشعة السينية بلورية. ناقل تعديل النظام هو أداة محسنة التي يمكن أن تستخدم للتعبير عن البروتينات الافرازية المؤتلف في المملكة الحيوانية، وكذلك.
لا بد لمعمل أبحاث لتكون قادرة على إنتاج كميات كبيرة من البروتينات المؤتلف متجانسة للأوصاف البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية، خاصة بالنسبة لدراسات الأشعة السينية بلورية. هناك العديد من أنظمة تعبير مغايرة راسخة مثل الإشريكيّة القولونية، الخميرة، خلايا الحشرات، وخلايا الثدييات، والخلايا النباتية، إلخ فيما بينها، ونظام التعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية واحد من أهم يشيع استخدام تقنيات لإنتاج كميات كبيرة من مطوية هيكلياً الحجم الكبير المؤتلف التوكسينات البروتينات ل بلورة البروتينات1.
ناقلات التعبير منظومة التعبير باكولوفيروس صممت لتحتوي على بوليهيدرين قوية أو مروج P10 لإنتاج عائد عالية من البروتينات داخل الخلايا المؤتلف2،3. جعل باكولوفيروس المؤتلف، هو استنساخ الجينات للفائدة إلى متجه الحشرات المحتوية على محور الجينوم multi-نوكليوبوليهيدروفيرال كاليفورنية أوتوجرافا بوليهيدرين (بلح). ثم يتم تعيين تسلسل البناء الناتجة ويتم التحقق من إطاره الصحيح القراءة المفتوحة (ORF). بناء الصحيح ثم أدخلت الخلية المضيفة الحشرات من خلال عملية تعداء. ويتم إدراج الجينات التي تهم الجينوم الفيروسي باقترانها مثلى. نتائج هذا الحدث في إنتاج الجينوم الفيروسي المؤتلف، التي replicates ثم إنتاج المؤتلف كما جزيئات الفيروس1.
الخلايا الحشرات التي هي الأكثر شيوعاً في نظام التعبير خلايا (Hi5) خمسة Sf9 وعالية. الخلايا Sf9 عزل الاستنساخ من Sf21، المستمدة من خلايا المبيض الخوادر Spodoptera فروجيبيردا، وخلايا Hi5 عزل الاستنساخ المستمدة من الوالدين ني تريتشوبلوسيا خلية المبيض خط TN-3684،5. ترانسفيكشنز المشارك، وتضخيم الفيروس، وفحوصات البلاك تجري على الخلايا Sf9، بينما يتم عادة تحديد الخلايا Hi5 لإنتاج كميات أكبر من البروتينات المؤتلف6. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا Hi5 ليست مناسبة لتوليد والتضخيم من نسلها الفيروس بسبب ميلها لإنتاج فيروسات المسخ. تقليديا، تعتبر درجة حرارة تتراوح من 25-30 درجة مئوية لتكون جيدة لزراعة خلايا الحشرات. ومع ذلك، أفيد أن 27-28 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى لخلية الحشرات النمو والإصابة7،8.
مطلوب إدخال تسلسل إشارة قوية تسبق الجينات للتعبير عالية من البروتينات يفرزها. أن دليل التسلسل إشارة كفاءة البروتين المؤتلف المترجمة في هيولى لإفراز البروتين وبوستترانسلاشونال التعديلات اللازمة لطي السليم وتحقيق الاستقرار3. تم اختيار إشارة الببتيد تسلسل، مثل باكولوفيروس تغليف البروتين GP64/67، ميليتين نحل العسل، وغيرها، لتيسير التعبير عن البروتينات الافرازية المؤتلف في نظم التعبير بوساطة باكولوفيروس3. ثبت الأخذ بإشارة الببتيد من GP67 إلى زيادة غلة التعبير يفرز بروتين المؤتلف، بالمقارنة مع استخدام الببتيد إشارة الجوهرية ل الجينات الهدف9. هيمولين بروتين هيموليمف من فراشة الحرير العملاقة سيكروبيا هيالوفورا، التي يسببها عند الإصابة بالبكتيريا10. نظراً لمستوى عال نسبيا من التعبير المستحث، يمكن استخدام تسلسل الجين الببتيد إشارة التوسط من أجل التعبير إفراز البروتينات المؤتلف في نظام الخلية باكولوفيروس الحشرات.
(أ) التمويل تراتشيري عنصر التمايز المثبطة عامل مستقبلات (تقرير التجارة والتنمية) وحبوب اللقاح مستقبلات كيناز 3 (PRK3) على حد سواء تنتمي إلى عائلة النباتات الغنية لوسين تكرار مثل مستقبلات كيناز (لر-رلك) من البروتينات11،12 . من أجل دراسة هيكل ووظيفة هذه الأسرة من مستقبلات البروتينات النباتية، كذلك فيما يتعلق بتسهيل وصف غيرها من البروتينات النباتية يفرز الهيكلية والبيوكيميائية، تم تعديل نظام التعبير الحشرات باكولوفيروس الخلية إلى تحسين الغلة جودة وإنتاج البروتين. المجالات خارج الخلية لتقرير التجارة والتنمية و PRK3 بنجاح وأعربت استخدام ناقلات التعبير معدلة اثنين في نظام التعبير خلية باكولوفيروس الحشرات. وقد تبلورت المجالين خارج الخلية البروتينات تقرير التجارة والتنمية، و PRK3. تقارير هذه المادة بالتعبير وتنقية كميات كبيرة من البروتينات النباتية يفرز المؤتلف مع ناقلات التعبير باكولوفيروس معدلة اثنين بإدماج GP67 أو تسلسل إشارة هيمولين بين المروج والاستنساخ لأغراض متعددة المواقع.
ونظرا للتنوع في الحجم واستقرار الآلاف من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية، من التجريبية لبحوث المختبرية تقرر أي نظام التعبير مغايرة قد يتم اختياره للتعبير عن البروتين محددة. نظام التعبير كولاي هو غالباً الخيار الأول لتعبير البروتين نظراً لدورة حياة قصيرة للبكتيريا، منخفضة ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل باستخدام أموال بدء التشغيل الجديد كلية من “جامعة ولاية كارولينا الشمالية” عن شو جوجو.
Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |