Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte
Summary
Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.
Abstract
Gut homing van immune cellen is belangrijk voor de pathogenese van inflammatoire darmziekten (IBD). Integrine-afhankelijke cel adhesie te addressins is een cruciale stap in dit proces en therapeutische strategieën die interfereren met de hechting met succes zijn vastgesteld. Het anti-α4β7 integrine antilichaam, vedolizumab, wordt gebruikt voor de klinische behandeling van ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) en verdere verbindingen zijn waarschijnlijk te volgen.
De bijzonderheden omtrent de hechting en de mechanismen van de actie van de anti-integrine antilichamen zijn nog steeds onduidelijk is in vele opzichten als gevolg van de beperkte beschikbare technieken voor het functioneel onderzoek op dit gebied.
Hier presenteren we een dynamische wrijvingscoëfficiënt assay voor de functionele analyse van menselijke cel adhesie onder stromingscondities en het effect van anti-integrine therapieën in het kader van IBD. Het is gebaseerd op de perfusie van primaire menselijke cellen tot en met addressin beklede ultradunne glas haarvaten met real-time microscopische analyse. De bepaling biedt een scala aan mogelijkheden voor verbeteringen en wijzigingen en potentieel voor mechanistische ontdekkingen en translationeel toepassingen houdt.
Introduction
Cel beweging is een stevig gereglementeerde proces onmisbaar voor de ontwikkeling en de functie van multi-cellulaire organismen, maar is ook betrokken bij de pathogenese van een veelheid aan ziekten1. Onlangs, heeft het homing proces van immuuncellen van de bloedstroom naar de perifere weefsels opgedaan steeds meer aandacht, omdat het bijdraagt tot aanvulling en uitbreiding van pathogene cellen in ontstoken weefsels in via het immuunsysteem veroorzaakte ziekten2 ,3. In het bijzonder is homing aangetoond dat translationeel relevantie in inflammatoire darmziekten (IBD). Het therapeutische anti-α4β7 integrine antilichaam vedolizumab bemoeien met gut homing werkzaamheid is gebleken in grote klinische proeven4,5 en is met succes gebruikt in de klinische praktijk levensechte6,7 , 8. verdere verbindingen zijn waarschijnlijk te volgen9,10. Het therapeutische anti-α4 integrine antilichaam, natalizumab, wordt ook gebruikt voor de behandeling van multiple sclerose (MS)11.
Onze functionele begrip van het homing proces in het algemeen en het werkingsmechanisme van dergelijke therapeutische antistoffen is in het bijzonder echter nog beperkt. Het is reeds lang gevestigd dat homing bestaat uit verschillende stappen waaronder cel binden en rollend met latere cel adhesie leidt tot stevige arrestatie gevolgd door trans endothelial migratie12,13. De bovengenoemde antistoffen neutraliseren verschijnsel op het celoppervlak voorkomen van interactie met addressins op het endotheel van de vaatwand. Dit wordt beschouwd als het belemmeren van de vaste cel adhesie14,15. Nog, we zijn pas net begonnen te begrijpen van de differentiële relevantie van specifieke verschijnsel voor cel homing van afzonderlijke cel deelverzamelingen. Bovendien, de effecten van anti-integrine antilichamen op verschillende cel subsets en dosis-respons-verenigingen zijn grotendeels onbekend leidt tot veel open vragen op het gebied van darm homing en Anti-adhesie therapieën in IBD.
Handige hulpmiddelen moeten dergelijke kwesties worden aangepakt zijn daarom hard nodig. Het effect van anti-integrine antilichamen op integrine-addressin interactie is tot nu toe voornamelijk beoordeeld door beoordeling van bindende werkzaamheid/bindende remming met stroom cytometry of via statische hechting assays16,17 ,18,19,20, dus met een schijnbare vereenvoudiging en afwijking van de fysiologische situatie. We onlangs een dynamische wrijvingscoëfficiënt assay om te bestuderen van integrine-afhankelijke hechting van menselijke cellen om te addressins en de effecten van anti-integrine antilichamen onder schuifspanning2gevestigd. Het beginsel van de techniek is eerder aangetoond met de muis cellen21,22. Hier, het werd aangepast en ontwikkeld om de hierboven genoemde translationeel kwesties worden aangepakt, openen nieuwe mogelijkheden beter begrijpen van de mechanismen van therapie met anti-integrine antilichamen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bovenstaande protocol beschrijft een nuttige techniek om te bestuderen van de dynamische wrijvingscoëfficiënt van menselijke immune cellen aan endothelial liganden. Door de variatie van de gecoate liganden, geperfundeerd celtypes of deelverzamelingen, incubatie met aanvullende stimuli of verschillende neutraliserende antilichamen, heeft het bijna onbeperkte toepassingsmogelijkheden. Deze dynamische wrijvingscoëfficiënt gehaltebepalingen kunnen dus nuttig zijn om te antwoorden op beide fundamentele vragen van fund…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek van CN, IA, MFN- en SZ werd gesteund door het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek (IZKF) en het ELAN-programma van de Universiteit Erlangen-Nuremberg, de anders Kröner-Fresenius-Stiftung, de Fritz-Bender-Stiftung, de Duitse Crohn en Colitis Foundation (DCCV), de klinische onderzoek groep CEDER van het Duits onderzoek Raad (DFG), het programma onderwerp DFG Microbiota, de opkomende Field Initiative en de DFG Collaborative Research centra 643, 796 en 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
