الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول هو المضيف قابلة للتكيف، وكله، أداة فحص عالية المحتوى التي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ويمكن استخدامها لاكتشاف المخدرات.
Abstract
عدد الأدوية الجديدة التي حددت بالتقليدية، في المختبر شاشات تضاءل، الحد من نجاح هذا النهج في البحث عن أسلحة جديدة لمكافحة مقاومة الأدوية المتعددة. وادي هذا إلى الاستنتاج بأن الباحثين لا تحتاج فقط إلى العثور على أدوية جديدة، ولكن أيضا بحاجة إلى تطوير طرق جديدة للعثور عليهم. بين المرشح الأكثر تبشيرا بالنجاح أساليب مسببة للجامعة، في فيفو فحوصات هذا الاستخدام الفائق، والمظهرية قراءات ويستضيف أن تتراوح بين ايليجانس كاينورهابديتيس دانيو rerio. هذه الأجهزة المضيفة لها العديد من المزايا القوية، بما في ذلك تخفيضات هائلة في عدد الزيارات إيجابية كاذبة، كما يتم عادة إسقاط مركبات سامة للمضيف و/أو بيونافيلابل في الشاشة الأولى، قبل متابعة مكلفة حتى.
هنا نعرض كيف استخدمت لدينا المقايسة لاستجواب تباين المضيف في الموثقة توثيقاً جيدا C. ايليجانس–الزائفة الزّنجاريّة قتل السائل باثوسيستيم. كما نبدي ملحقات عدة لهذا الأسلوب جيدا عملت بها. على سبيل المثال، نحن قادرون على الاضطلاع بشاشات الجينية الفائق باستخدام [رني] في بئر 24 أو 96 لوحة الأشكال لعوامل المضيف الاستعلام في هذا التفاعل المضيف الممرض. باستخدام هذا التحليل، يمكن أن تكتمل شاشات الجينوم كله في بضعة أشهر فقط، التي يمكن تبسيط مهمة تحديد أهداف المخدرات، يحتمل أن تكون دون الحاجة إلى اتباع نهج التنقية البيوكيميائية شاقة بشكل كبير.
نحن أيضا تقرير هنا تلاف أسلوب لدينا بدائل بكتيريا إيجابية faecalis البرازية الممرض الغرام P. الزّنجاريّة. كثير كما الحال بالنسبة P. الزّنجاريّة، قتل faecalis هاء- تعتمد على الوقت. على عكس السابق C. ايليجانس– فحوصاتفايكاليس هاء ، ولدينا المقايسة faecalis هاء- لا يتطلب برينفيكتيون، تحسين صورتها السلامة وتقليل فرص تلوث معدات مناولة السائل. المقايسة قوية جداً، عرض ~ 95% معدلات الوفاة 96 ساعة بعد الإصابة.
Introduction
تحديد وتطوير المضادات الحيوية واسعة الطيف، وفعالة، الآن تقريبا قبل قرن من الزمان، أدت إلى لحظة فاصلة في مجال الصحة العامة حيث كان هناك اعتقاد على نطاق واسع أن المعدية المرض سيكون آفة من الماضي. في بضعة عقود قصيرة، بدأ هذا التفاؤل إلى الزوال، الممرض بعد الممرض وضعت آليات المقاومة التي تحد من هذه العلاجات المعجزة مرة واحدة. لبعض الوقت، ويبدو أن سباق التسلح بين الجهود الرامية إلى اكتشاف المخدرات ومسببات الأمراض متوازنا. ومع ذلك، قد توجت إساءة استخدام مضادات الميكروبات مؤخرا في ظهور سلالات مقاومة للعقاقير عموم الكلبسيله الرئويةو راكدة بوماني، السراتية marcescensو, P. الزّنجاريّة1 2،،من34.
من P. الزّنجاريّة انتهازية، غرام السلبية، متعدد المضيف ممرض أن تهديدا شديدا للمرضى الذين يعانون من حروق شديدة، أولئك الذين هم المناعة أو التليف الكيسي. فإنه يتم تعريف أيضا بصورة متزايدة كعامل المسبّب للمرض في العداوي المستشفوية شديدة، لا سيما بسبب حيازته الجارية لمقاومة مضادات الميكروبات. للبدء في التصدي لهذا التهديد، وقد استخدمنا موثقة توثيقاً جيدا C. ايليجانس–P. الزّنجاريّة عدوى النظام5. وقد الاستدانة لدينا مختبر هذا النظام لتطوير منصة فرز المستندة إلى السائل، والفائق، وعالية المحتوى لتحديد المركبات الرواية التي تحد من قدرة مسببات المرض قتل المضيف6. الفضول، تبدو هذه المركبات تنتمي إلى مالا يقل عن ثلاث فئات عامة، بما في ذلك مضادات الميكروبات7 وضراوة مثبطات8. وردت أخرى فحوصات اكتشاف المخدرات عالية المحتوى في C. ايليجانس لبكتريا توبيركولوسوم، والمتدثرة الحثريه، واليرسينيا بيستيس، الليستريه المستوحدة، فرانسيسيلا تولارنسيس، المكوّرات العنقودية الذهبية، المبيضات البيض، و فايكاليس البرازية، بين أمور أخرى9،10،11،،من1213،14،،من1516. هذه الأنواع من فحوصات لها العديد من المزايا المعترف بها جيدا، مثل الحد من يضرب الإيجابية الكاذبة التي قد تكون سامة للبلد المضيف والممرض، احتمال زيادة التوافر الحيوي بالمقارنة مع شاشة كيميائية، والقدرة على تحديد عدد الزيارات خارج مجرد الحد من نمو الميكروبات، مثل مكافحة فيرولينتس أو جزيئات محفزة محصنة ضد المركبات إلا إمالة توازن التفاعل المضيف الممرض صالح السابقة. بالإضافة إلى ذلك، أن المركبات التي اكتشفت في هذه الشاشات غالباً ما تكون فعالة في الثدييات المضيفين.
تجدر الإشارة إلى أن مالا يقل عن اثنين آخرين فحوصات17،18 متاحة للاضطلاع بشاشات الفائق في C. ايليجانس في السائل. ومع ذلك، كل من هذه الاختبارات هو تعديل يسمح الإنزيم المعوية الاستعمار تنميط، المعروف بالقتل البطيء، يمكن أداؤها في السائل، زيادة الإنتاجية، والسماح لمركبات فحص أكثر سهولة. وقد أظهرت توصيف دقيق قاطع أن آليات الفوعة الجرثومية المختلفة بين هذه الاختبارات ولدينا الشاشة المستندة إلى السائل7. إذ لوحظت كلا النوعين من ضراوة في نظم الثدييات، من المهم النظر المحدد ضراوة الذي هو الأكثر ملاءمة لمصالح المجرب قبل اختيار المقايسة.
هنا نظهر إصدار محسن من السائل على أساس مقايسة C. ايليجانس P. الزّنجاريّة . ونحن أيضا تقرير تكييف أسلوب التحليل القائم على سائل لدينا لاستيعاب الممرضات البكتيرية إيجابية البرازية faecalis. مثل P. الزّنجاريّة، يتم تعريف faecalis هاء- يتزايد كتهديد خطير المستشفيات مع تسلح متزايد لمقاومة مضادات الميكروبات مسارات1. على الرغم من وجود أسلوب سابقة للفرز الفائق من faecalis هاء- 14، فإنه يتطلب بريينفيكشن مع مسببات المرض، مما يزيد من تعقيد الإجراءات ويزيد من احتمال تلويث المعدات مثل فلووسورت COPAS. لدينا بروتوكول يلغي الحاجة لقبل الإصابة، تحسين السلامة الشخصية. أخيرا، نحن التقرير وسيلة بها أي من هذه الاختبارات يمكن دمجها مع تغذية [رني]، مما يتيح للمستخدم البحث عن المضيف من العوامل التي تلعب دوراً في إنشاء، أو مقاومة للعدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا الإنزيم (أو فحوصات مماثلة حيث يتم استبدال مسببات الأمراض الأخرى عن P. الزّنجاريّة أو هاء-faecalis) مفيدة لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك اكتشاف المخدرات. كما أنها مفيدة لمعالجة المسائل البيولوجية الأساسية، مثل تحديد عوامل الفوعة، توضيح سبل الدفاع المضيف، وتحديد الآلية الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة بالوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من ولاية تكساس (كبريت) جائزة RR150044، ج المنح البحثية مؤسسة ولش-1930، ومن المعاهد الوطنية من AI110552 K22 على الصحة، منح NVK. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
References
- Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
- Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
- Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
- Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
- Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
- Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
- Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
- Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
- Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
- Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
- Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).
- Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
- Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
- Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
- Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).
- Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).
- Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).
- Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
- Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
- Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).
- Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
- Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
- Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
