Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse
Summary
Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.
Abstract
Es ist ein wichtiges Anliegen in den Neurowissenschaften wie verschiedene Arten von Neuronen arbeiten auf neuronale Schaltkreise. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben die Identifizierung des neuronalen in in Vivo elektrophysiologischer Experimente in breiten Hirnregionen aktiviert. Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Jedoch ist es oft schwer zu Anregung Licht an den tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns liefern. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Hier beschreiben wir eine Methode um Spike Antworten auf das Licht von einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in den tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.
Introduction
Das zentrale Nervensystem besteht aus verschiedenen Arten von Neuronen, die unterschiedliche Funktionen haben. Wie diese verschiedenen Arten von Neuronen innerhalb der neuronalen Schaltung funktionieren, ist eines der wichtigsten Anliegen in den Neurowissenschaften. In vielen Regionen des Gehirns war es jedoch unmöglich, die neuronalen Typen in in-Vivo -Aufnahmen der elektrischen Aktivitäten zu unterscheiden, denn es keinen klaren Unterschied in der elektrischen Spike-Signal selbst, mit einigen Ausnahmen gibt. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben einen Durchbruch1,2. Mit transgenen Tieren in der lichtempfindlichen Opsin (z.B.Channelrhodopsin-2) in bestimmten neuronalen Arten ausgedrückt ist, wurde es möglich, die neuronalen Arten effizient in in Vivo Aufnahmen3, 4,5,6. Bei diesen Tieren die Neuronen mit lichtempfindlichen Opsin sind durch lichtreize während der elektrische Aufnahmen geben aufgeregt, aber anderen Neuronen sind nicht. Opsin-positiven Neuronen, zeichnen daher leicht von anderen Neuron durch ihre Reaktionen auf Licht.
Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Als nicht-invasive Methode richtet das Licht oft von Oberfläche des Gehirns. Jedoch weil das Licht Stärke verringert während es Hirngewebe durchläuft, ist es schwer, die tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns zu stimulieren. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Elektrophysiologische Experimente wurden oft an narkotisierten Tieren durchgeführt, weil die Bewegung des Körpers Lärm in den Aufnahmen verursacht. Wie gut dokumentiert ist, ist jedoch Anästhesie bekannt, um die neuronalen Antworten7,8,9,10zu ändern. Daher ist es notwendig, wach Tiere zu nutzen, um neuronale Reaktionen ohne künstliche Effekte der Narkose zu studieren. Im Gegensatz zu den Experimenten mit narkotisierten Tieren werden die elektrophysiologischen Aufnahmen nach der Erholung von der Operation in den Experimenten mit wach Tieren durchgeführt. Während der Zeit zwischen der Operation und die Aufnahmen Gewebe Exsudat oft sammelt sich auf der Oberfläche des Gehirns und macht die optische Transparenz von der Oberfläche des Gehirns gering.
Hier beschreiben wir eine Methode um Monoblock-Aufnahmen aus einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden. Es ist verwendet worden, für bestimmtes Neuron Typen in Vivo zu identifizieren sowie die Aktivitäten der spezifischen neuronalen Bahnen zu manipulieren. Die Klärung der neuronalen Aktivitäten der verschiedenen neuronalen Arten fördert das Verständnis des Mechanismus der neuronalen Schaltkreise. Hier haben wir eine Methode, um das Licht um die Aufnahme-Site durch eine Glaselektrode im IC von wach VGAT-ChR2 Mäusen zu liefern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurden die Autoren von der Japan Society for Promotion of Science KAKENHI Grant JP16K11200 und 17 H 02223 und der Zuschuss für die Forschung von Kanazawa Medizinische Universität S2016-8 und C2017-3. Wir danken Yuhichi Kuda für seine Unterstützung bei der Aufnahme der Fotos.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
