細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

人間行列その制度審査委員会 (IRB) からの承認を得て商業ソースから購入したが、感染の危険性として扱う必要があります。使用される実験室環境安全12の文化を維持することを確認します。 1. 測定を開始する前に 製造元の手順13によると磁気ビーズ ERT 共役ストレプトアビジンを準備します。 品質コントロールのサンプル (QCs) の準備: スパイク (例えばプールされた髄液や血清) の種特異的なマトリックスのポジティブ コントロール抗体 (PC) (例えばNAb)。注: FDA と EMA のガイダンスは、高および低品質管理分析バリデーション及び日常1,14のテストの準備をお勧めします。 たとえば、10 μ G/ml で QC を取得するで、(例えばCSF) 関連する行列の 990 μ L にその 1,000 μ L の総ボリュームの 1 mg/mL 在庫肯定的な制御の 10 μ L を追加します。 分注単一に適したボリュームで QC サンプルは (例えば、50 μ L) を使用して、-80 ° C1-60 で因数を凍結します。 カット-ポイント-コントロール (CC)、単一のテスト記事 (例えばプールされた髄液や血清) と扱われない特異行列因数 (例えば、50 μ L) を使用し、-80 ° C1-60 で因数を凍結します。 蛍光体と製造元のプロトコル15に従ってタンパク質ラベリング キットを使用して専門家の抱合反応を実行します。割り切れる単一に適したボリュームでサンプル (例えば、50 μ L) を使用し、因数-60–80 ° C で凍結 2 1 日目: セルめっきおよびサンプル準備 細胞板の準備 ティッシュ文化フードを使用し、次の手順のための無菌環境を維持します。70% のエタノールとフードで配置され、クリーンな環境16,17,18が維持される各オブジェクトをスプレーします。 細胞分化培地 (例えば10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを RPMI 1640) を 37 ° C19水かビーズのお風呂で暖かい。 カウント ヒト T リンパ球 Jurkat 細胞およびプレート 100 μ L/ウェル 7.5 x 105セル/mL 96 ウェル丸底で細胞培養プレート プレート ローダー装備流れの cytometer で使用する適切です。 たとえば、セル20,21をカウントするのに診断または自動化された細胞カウンターを使用します。 セルが少なくとも 70% を持っているを確認実験を行う前に生存率 (例えば、トリパン ブルー染色の実行可能性を評価)17。 14-20 h のために夜通し 5% CO2と 95% 湿度 37 ° C のインキュベーターでセルを孵化させなさい。 スクリーニング サンプル準備 件名に希釈又は血清自由な媒体 (例えば、RPMI 1640) を使用してコントロールのサンプルを分析します。例のメソッドここでサンプル 1:2.5 RPMI 1640 年に 60 μ L のサンプルを 90 μ L の血清無料メディアに追加することで希釈します。(例えば、8 ストリップ管)。3.1 蛍光ラベルの専門家を準備する試金プロシージャのための手順に進みます。注: 1:2.5 の希釈は実験的に決定された、ここで紹介した方法に最適です。開発は各メソッドの最適な試料の希釈を決定してください。 確証ビードおよびサンプル準備 検証サンプルに必要な専門家共役のビーズの数を計算します。 例では、10 個のサンプルの使用サンプル + 30% 余分な洗浄工程中に任意の損失を補うためにあたり専門家共役ビーズ 10 サンプル x 100 μ = ERT 共役ビーズの 1,300 μ L。 渦ビーズ徹底的に。洗浄用 15 mL の円錐管にビーズの計算の数を追加します。 結合バッファーまたは (例えば0.1% ポリソルベート 20 をリン酸緩衝生理食塩水) の製造元が推奨する、1,300 μ L を追加することによって専門家共役の磁気ビーズを洗う13以下の手順します。 渦管徹底的に。2 分間磁気管ラックにチューブを置きます。ビーズを乱すことがなく慎重に吸引し、上澄みを廃棄します。注: オフにビーズが磁石に引っ張られるときに褐色からソリューションになります。 バッファーを結合の 1,300 μ L でビーズを再懸濁します。合計 4 つの洗浄の洗浄手順を繰り返します。 最終的な洗浄後 (以前 2.3.1.1 のステップで計算された) バッファーを結合の 1,300 μ L でビーズを中断します。96 ウェル、白、丸底によく、プレート マップ (例えば、1 つのサンプルまたは QC あたりも検証; 蛍光ラベル ERT で培養したときに、重複分割サンプルが) によると非バインド ポリプロピレン板あたり 100 μ L を追加します。 96 ウェル側スカート付きマグネット プレートを置き、ペレットを形成するためにビーズを許可します。慎重に明確な上清を吸引し、それを破棄します。注: ソリューションになります暗いから茶色側スカート磁石の約 1-2 分後に明らか。得られたビーズは、「ドライ」ビーズと呼ばれます。 サンプルは肯定的なスクリーニングし、確認されているが、適切な割り当てられたにも ERT 共役ビーズと各サンプルを 100 μ l 添加するを追加します。プラスチック フィルムでプレートをシールし、シェーカーは室温 (RT) で約 800 rpm 上少なくとも 60 分間振る。注: 以前の準備し、正と負を冷凍 QCs と CC が含まれますすべてのプレートに。 、孵化後 96 ウェル側スカート磁石に確証のプレートを置き、ペレットを形成するためにビーズを許可します。 価希釈系列の作製 価シリーズを準備、連続カット ポイント1所定の価を横断する十分な回数のプールのマトリックスのサンプルを希釈します。 たとえば、60 μ L 8 希釈 (例えば、8 ストリップ管) の合計のための 1:3 希釈系列でプールされたマトリックスのサンプルの 30 μ L をミックスします。3.1 蛍光ラベルの専門家を準備する試金プロシージャのための手順に進みます。 3. 1 日目: 試金プロシージャ (例えば、60 μ L まあ、または約 6 mL/プレート/) 無血清培地で蛍光ラベル ERT を準備します。 たとえば、1 μ g/mL の 10 mL を準備する蛍光標識は ERT ストック 1 mg/mL の 10 μ L を追加蛍光標識血清自由な媒体 (例えば、RPMI 1640) 9.99 mL に専門家レビュー チーム。 新しい培養プレート (例えば、96 ウェル、白、丸底、拘束力のないポリプロピレン プレート)、追加作製した試料からステップ 2.2、2.3、または 2.4 および重複する井戸 (例えば、それぞれの転送 60 μ L の 1:1 混合物の蛍光ラベルの専門家サンプルを準備し、60 μ L/ウェル蛍光ラベル ERT を追加)。注:図1 実験プレート マップの例が提供されます。 図 1: 実験板レイアウトの例です。サンプルおよび蛍光標識 ERT は、2-8 ° C で夜通し孵化しました。高品質管理 (HQC)、低品質管理 (LQC)、負の品質管理 (NQC) などのコントロールは、上映され、プレートの均一性を評価するためにプレートの反対のコーナーで確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 マルチ チャンネル ピペットを上下に数回をピペットでサンプルと蛍光標識 ERT を混ぜます。ホイルは、プレートをラップし、14-20 h の 2-8 ° C でそれらを一晩インキュベートします。 4 2 日目: 作製した試料をセルに追加します。 2-8 ° C に加温からサンプルの培養プレートを外し、プレートを 10-15 分の 37 ° C でビーズのお風呂に置くことによって暖かい。 CO2インキュベーターからセルを削除します。めっきされたセルのセルが井戸17,19全体健康と均等に配置された表示されるように倒立顕微鏡を使用しての目視チェックを実行します。 板実験地図によるとセル板に以前混合試料の蛍光ラベル ERT 100 μ L を追加します。 37 ° C で CO2インキュベーターに戻って追加のサンプル細胞プレートを置き3 h と ± のプレートをインキュベート 15 分。注: 今回は、アッセイの信号対ノイズ応答に最適としてラボで設立されました。 遠心分離機の 14-18 ° C で卓上遠心分離機で 320 x gで 6 分のセル板プレートのウェルの底で細胞ペレットの存在を確認します。 プレートを 30 ~ 45 ° の角度で保持します。細胞ペレットを乱すことがなく各ウェルから上澄みを慎重に取り外します。各ウェルに、細胞を再懸濁します細胞ペレットに 1 x DPBS の 200 μ L を追加します。 セル洗浄 3 洗浄の合計のための手順を繰り返します。細胞生存率の染色は、手順 5 に進んでください。 5 2 日目: セル実行可能性の染色 マルチ チャンネル ピペットを使用して、蛍光標識 ERT は、異なる波長を選択し、製造元の手順22に基づき、各ウェルに 100 μ L ライブ/デッド汚れ x 1 の実用的なソリューションを追加します。 暗闇の中で常温 15 分間プレートを孵化させなさい。14-18 ° C で卓上遠心分離機で 320 x gで 6 分のプレートを遠心分離します。 細胞ペレットを乱すことがなく各ウェルから上澄みを慎重に取り外します。洗浄セル 1 1 x DPBS と x。 6. 2 日目: 固定 1% パラホルムアルデヒドとセル マルチ チャンネル ピペットを使用して、各ウェルに 100 μ L 冷蔵 (2 ~ 8 ° C) での 1% パラホルムアルデヒド (PFA) を調剤します。 シール プレートと優しくパルス渦をミックスします。ホイルは、プレートをラップし、固定のために少なくとも 10 分 2-8 ° C に配置。注: プレート シールに水しぶきを避けるように注意します。 分析の前に上下にマルチ チャンネル ピペットを使用して各ウェルに 1 x DPBS の 50 μ L を追加します。 7. フローサイトメトリー プレート ローダーと流れの cytometer でプレートを置き、それらを実行します。 取得し、流れの cytometry のソフトウェアを使用して測定の平均蛍光強度 (MFI) を記録 (材料の表を参照してください)。注: は、ブートローダーの設定の例として図 2を参照してください。サンプル フロー レート、サンプル ボリューム、ボリューム、混合の速度、およびミックスの数を混合は、このアッセイに最適です。これらの基準は、流れ cytometry 集録ソフトウェア23によって、条件ごとに、番号の横に「矢印」をまたは「ダウン」ボタンを使用して調整できます。 図 2: 流れの cytometer ブートローダーの設定の例です。ブートローダーの設定を最適化して開発されたそれぞれの試金のためください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 プロットの作成、cytometer分析/ゲート/図 3に示すように。注: ゲートの作成とアプリケーションは、各流れの cytometry ソフトウェア23のため異なる場合があります。 図 3: フローサイトメトリー戦略をゲーティングします。Jurkat 細胞はイベントの総数から分離され、側方散乱 (SSC) チャンネルと前方散乱 (FSC) をプロットし、ターゲット人口のまわりのゲートを描画によって収集されました。ダブレットから分離したシングレット (単一セル) またはより大きいセルの集計 FSC 領域を使用して (FSC-A)、FSC 高さ (FSC H) チャンネル。生きているセルは、一重項細胞生存の汚れのため負のゲートによって選ばれました。平均蛍光強度 (MFI) シングル、ライブ Jurkat 細胞で測定し、, ヒストグラムとしてプロットされます。薬物吸収と細胞の MFI の値 (例えばHQC) ブロックし、制御と細胞の吸収量が示されている (赤と青、それぞれ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 死んだ細胞を解析から除外し、23のおよそ 10,000 のイベントを記録します。 8. データ分析 (生 MFI) データを解析ソフトにエクスポート (材料の表を参照してください)。注: 必要な分析によって次のデータ分析を実行できること解析ソフトウェア。 平均 (QCs とサンプル) 重複する井戸の MFI との変動 (CV %) 平均から重複のスプレッドの変動を評価する係数を計算します。 サンプルおよびアッセイに上映された QCs を計算の割合信号抑制 (%si) の平均の MFI を基準にして、QCs プールされたマトリックス CC。 必要な場合は、確認の QCs とサンプル画面の対応する値を基準にして回復率 (Rr) を計算します。