Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование
Summary
Здесь мы покажем, как использовать Assay лигирование близости (НОАК) для визуализации MST1/MST2 heterodimerization в фиксированных ячейках с высокой чувствительностью.
Abstract
Регулируемые белок белковых взаимодействий являются руководящим принципом для многих событий, сигнализации, и обнаружение таких событий является важным элементом в понимании того, как организованы такие пути и как они функционируют. Есть много методов для обнаружения белок белковых взаимодействий в клетках, но относительно немногие может использоваться для определения взаимодействия между эндогенного белков. Один из таких методов, близость лигирование пробирного (НОАК), имеет несколько преимуществ рекомендовать ее использование. По сравнению с другими общие методы анализа взаимодействия протеин протеина, PLA имеет относительно высокую чувствительность и специфичность, могут выполняться с минимальными клеток манипуляции и в протоколе, описанные здесь, требует только два целевых антитела, полученных от разных видов (например., от мыши и кролика) и одно специализированное реагента: набор вторичных антител, которые являются ковалентно связан с конкретным олигонуклеотиды, когда принес в непосредственной близости друг от друга, создать Мы платформа в situ ПЦР или подвижного круга амплификации. В этой презентации мы покажем как применять технику НОАК визуализировать изменения в MST1 и MST2 близости в стационарных клетках. Метод, описанный в этой рукописи особенно применима для анализа клеток сигнализации исследования.
Introduction
Нарушение MST1/Бегемот сигнализации были связаны с отклонениями и канцерогенеза1. В млекопитающих, активировать киназы MST1 и MST2 (фосфорилировать) MOB1 и LATS1/2, последний из которых затем фосфорилирует и инактивирует транскрипционный анализ совместного активатор да связанные белком (YAP)2. В его активную форму (unphosphorylated) Яп имеет онкогенных активность, повышение транскрипцию генов распространения клеток; и наоборот когда YAP инактивированная Бегемот дорожка, пролиферацию клеток подавляется и апоптоз передовой3. В тканях существуют главным образом в качестве активного homodimers, MST1 и MST2 но онкогенных раздражителей может увеличить уровни гетеродимерами MST1/MST2, и такие гетеродимерами являются неактивными4. Однако как регулируется MST1/MST2 heterodimerization по-прежнему осознаются. Гомо – и гетеродимерами, опосредованное через взаимодействия между регионами биспиральных C-терминала MST1 и MST2, известная как Сара домены5. Использование в situ PLA продемонстрировал в этой статье, мы покажем присутствие гетеродимерами MST1/MST2 в клетках человека Шванновские клетки (HSC) и человеческих эмбриональных почек (ГЭС-293). PLA имеет преимущество перед другими методами обнаружения взаимодействия протеин/потому что она позволяет обнаруживать эндогенного белок белковых взаимодействий, которые могут быть определены и количественно без необходимости трансген выражения или использование epitope тегов 6.
Сигнальных путей значительной степени контролируется ассоциацией условного компонента белков. К примеру стимуляция большинства рецепторов тирозин киназ приводит к их гомо – и гетеро димеризации и последующего объединения с дополнительной внутриклеточных сигнальных белков, которые сами формы дальнейшего комплексов. PLA метод предназначен для визуализации близости между белков в клетках, условии, что белки не менее 30-40 Нм друг от друга. Близость белка обычно определяется первой инкубации клеток с соответствующей первичной антител, поднятые в различных видов (например., кролик и мышь) против каждый протеин, затем добавляя вегетационных вторичные антитела, предварительно спаренных к краткости ДНК зонды. Если ДНК-зонды находятся в непосредственной близости, конкретных ссылок ДНК олигонуклеотида одновременно можно связать оба эти зонды, формирование платформы для усиления в situ ПЦР или подвижного круга механизм. Флуоресцентный теги, добавленные к реакции амплификации позволяют визуализация взаимодействия белков, которые появляются как люминесцентные точки, которые могут быть легко количественно и локализованы в отдельных регионах в ячейке7,,8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы нашли его полезным использовать стекло камеры слайды для этого эксперимента, как это очень удобно для выполнения эксперимент с несколькими линиями клетки (14-16), и нет необходимости изменить образец каждый раз во время анализа в микроскопии. Несколько осложнения могут возникать, напр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим весь Чернова лаборатории для содействия оптимизации и проверки этого протокола, в частности Мария Раду и Семенова Галина. Мы также благодарим Андрей Ефимов визуализации объекта ячейки на рака Фокс Чейз центр. Эта работа была поддержана гранта NIH (R01 CA148805) для JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
