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Biology

Método diagonal medida sinergia entre qualquer número de drogas

Published: June 21, 2018
doi:
10.3791/57713
, , ,
1Faculty of Engineering and Natural Sciences,Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center,Sabanci University, 3Laboratory of Systems Pharmacology,Harvard Medical School

Summary

Neste protocolo, descrevemos como fazer Loewe medições de interação de drogas baseadas em aditividade para pairwise e combinações de drogas de três vias.

Abstract

Uma combinação sinérgica de drogas tem uma eficácia maior em comparação com os efeitos das drogas individuais. Ensaios de tabuleiro de damas, onde drogas são combinadas em doses muitos, permitam a medição sensível de interações medicamentosas. No entanto, estes ensaios são caros e não se adapta bem para medir a interação entre muitos medicamentos. Vários estudos recentes têm relatado as medições de interação de drogas usando uma amostragem diagonal do ensaio do xadrez tradicional. Esta metodologia alternativa grandemente diminui o custo das experiências de interação de drogas e permite a medição de interação para combinações com muitas drogas. Aqui, descrevemos um protocolo para medir as três interações emparelhadas e uma interação de três vias entre três antibióticos em duplicado, em cinco dias, usando apenas três microplacas de 96 poços e equipamentos de laboratório padrão. Apresentamos resultados representativos, mostrando que a combinação de três-antibiótico da penicilina G + Levofloxacina + ácido nalidíxico é sinérgica. Nosso protocolo escalas medir as interações entre muitas drogas e em outros contextos biológicos, permitindo a telas eficientes para múltiplas drogas sinergias contra patógenos e a tumores.

Introduction

Combinações de drogas podem apresentar efeito surpreendentemente alto ou baixo em um fenótipo dado os efeitos das drogas constituintes, correspondente a interações medicamentosas sinérgicas ou antagônicas, respectivamente,1,2,3. O uso de combinações sinérgicas pode permitir dose-escalonamento para aumento da eficácia e redução de dose para alívio de efeito colateral. Tratamentos de combinação podem igualmente aplicar vários contratempos a maquinaria celular, bloqueando potenciais mecanismos de fuga evolutiva para resistência4. Portanto, as combinações de três ou mais drogas são rotineiramente usadas em patógeno ou câncer tratamento5.

Sinergia e antagonismo são definidos por uma comparação entre os efeitos observados de uma combinação contra um efeito esperado, tendo em conta os efeitos de drogas individuais. Entre os modelos para interações medicamentosas, aditividade Loewe é a mais exigente e tem um modelo bem definido nulo (Figura 1)6, e a interação de sinergia/antagonismo inferido é independente da concentração da droga usada 6 , 7. no entanto, o modelo de Loewe é experimentalmente caro mesmo para um teste de interação emparelhadas. Ensaios de interação droga tradicionalmente são compostos por uma matriz 2D de combinações de concentração da droga (um ensaio de quadriculado) (Figura 2). 5 doses são usados para cada droga, se 25 combinações são necessárias, correspondente a uma metade de uma microplaca se são conduzidos experimentos em replicar. O custo desta abordagem proíbe medição sinergia pelo modelo de aditividade da Loewe para combinações de múltiplas drogas (Figura 3). Por exemplo, para testar uma 10-forma interação, métodos tradicionais exigiria mais de 100 mil microplacas, barrando a medição experimental de alta-ordem sinergias pelo modelo de aditividade Loewe rigoroso, bem teorizado e independente de concentração 8.

Tratamentos clínicos atuais utilizam apenas uma fração de combinações de drogas possíveis. Por exemplo, o tratamento padrão da tuberculose activa é uma combinação de três antibióticos. Existem aproximadamente 20 antibióticos usados no tratamento de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Há combinações possíveis de 3 vias 1140 entre 20 drogas, cada um com potencial para ter uma forte sinergia contra Mtb. Como não houve nenhum método cost-effective para medir as interações medicamentosas entre muitas drogas, combinações sinergéticas potencialmente salva-vidas permanecem não testadas.

Aqui, descrevemos um protocolo simples para medir interações medicamentosas emparelhadas e três vias por amostragem somente a diagonal de um ensaio de xadrez (,Figura 4 e Figura 5). O conceito subjacente de amostragem da diagonal de um experimento de xadrez foi teorizado por Berenbaum em sua obra seminal em 19789. Ainda, esta abordagem só recentemente tem sido aplicada a droga sinergia telas10,11,12. Apresentamos o nosso protocolo com Escherichia coli (e. coli) e o fenótipo de crescimento. No entanto, notamos que o protocolo é independente das espécies biológicas e fenótipo de interesse e, portanto, pode ser aplicado para a medição da sinergia de drogas de alta ordem em outros contextos biológicos.

Protocol

Nota: Qualquer pequena molécula que inibe o crescimento de bactérias e. coli pode ser usada para o método diagonal. Neste protocolo, levofloxacina (LEV), ácido nalidíxico (NAL) e penicilina G (PNG) irão ser usado como um exemplo, já que estas drogas mostram uma sinergia de três vias saliente. O fluxo de trabalho do presente protocolo é mostrado como Figura 6. Realize todas as medidas à temperatura ambiente. Use o frescas alíquotas de bactérias e drogas cada dia. Realize o experimento sob níveis de biossegurança adequados para Escherichia coli. 1. etapas de preparação Preparar a mídia de Luria-Bertani (LB) com a adição de 25 g de caldo LB para 1 L de água destilada e misturar. Autoclave a 121 ° C por 15 min e loja a mídia autoclavada à temperatura ambiente. Preparar ações de glicerol de Escherichia coli , misturando volumes iguais de estéril 50% de glicerol e células bacterianas diluídas para OD600 = 1 caldo LB e congelar 150 alíquotas µ l em tubos de 1,5 mL microcentrifuga a-80 ° C. Dissolva 20 mg de antibióticos, LEV, NAL e PNG em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) cada. Dilua o LEV solução 100 x 0,2 µ g/ml misturando-se 10 µ l de solução LEV com 990 µ l de DMSO. Use LEV de 0,2 mg/mL e 20 mg/mL NAL e PNG nas etapas do processo. Alíquota 50 µ l de cada antibiótico para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e congelar a-20 ° C. Tome um 150 µ l alíquota de e. coli de-80 ° C. Degelo. Adicione 100 µ l de estoque de glicerol de Escherichia coli em 5 mL de LB mídia em um tubo de cultura de 14 mL. Agite os tubos em uma incubadora de 37 ° C durante a noite a 200 rpm. 2. serial diluição experimento de Dose-resposta Tomar uma alíquota de drogas LEV, NAL e PNG de-20 ° C, deixá-los à temperatura ambiente durante 10 minutos descongelar e preparar diluições em série destas drogas. Prepare 1100 µ l da LB – 10% sol misturando 990 µ l de LB mídia e 110 µ l de solvente (DMSO). Prepare 500 µ l de LEV LB – 10% através da mistura de 450 µ l de LB mídia e 50 µ l de LEV. Sol de vórtice LB – 10% para 5 s na configuração mais alta. Adicione 20 µ l de sol LB – 10% para as linhas top 4 dos poços de uma microplaca de 96 poços. Vórtice LEV LB – 10% para 5 s na configuração mais alta. Adicionar 20 µ l de LEV LB – 10% para o primeiro poço em linha A. Prepare-se dupla diluição serial Lev LB – 10%, tendo 20 µ l do primeiro poço, adicionando ao segundo poço, pipetagem e descer cinco vezes. Repita isto para todos os poços sequencialmente até 11 bem, que acaba com 40 µ l (Figura 7A). Remova e descarte a 20 µ l do conteúdo da 11ª bem, usando uma micropipeta. Repita as etapas 2.3-2.7 para as drogas NAL e PNG usando as segunda e terceiros linhas do microplate, respectivamente. Repita as etapas de 2,3-2,7 pela droga LEV novamente na quarta linha como um controle positivo interno. Usando um spectrophotometer, medir o OD600 de um 01:10 diluição da cultura (etapas 1.5-1.7). Dilua as células em 5 mL de LB mídia para uma OD600 de 0,01. Despeje em um reservatório. Utilizando uma micropipeta multicanal, adicione 80 µ l de células diluídas para as diluições de série drogas preparadas no passo 2.4-2.9. As concentrações de droga final em cada poço é mostrado na Figura 7A. A placa para evitar a evaporação do selo. Incubar a placa para 16 h a 37 ° C. Inicie uma nova cultura bacteriana usar na etapa 3 (repita etapas 1.5-1.7). 3. linear diluição experimento de Dose-resposta Medir a absorvância de600 OD para placa de dose-resposta de diluição serial da etapa 2, usando um leitor de placas (Figura 7A certo) e interpretar os resultados com base nas etapas seguintes. Normalizar o crescimento, dividindo-se o crescimento em cada poço, com o crescimento no controle nenhuma droga para cada linha e calcular o crescimento percentual normalizando OD600a condição nenhuma droga. Para cada droga, localize os poços que têm inibição do crescimento de ~ 50% (IC50), mostrada em laranja na Figura 7A certo. Atribua a concentração nesses poços como “IC50 serial” para cada droga. Descongelar as alíquotas de droga fresca, prepare-se 1 mL de LB – 10% sol misturando LB mídia e solvente (DMSO) em uma proporção de 9:1 e LB – 10% drogas misturando LB mídia e drogas na proporção de 9:1, onde a concentração da droga é 100 x de serial IC50 do cada droga antes de adicionar a mídia LB , escolhido no passo 3.3. Prepare-se linearmente crescentes doses de drogas LEV, NAL e PNG 11 concentrações, misturando drogas LB – 10% e sol LB – 10% em volumes, mostrado na Figura 7B. Prepare-se linearmente crescentes doses de LEV na quarta linha como um controle positivo interno. Medir o OD600 das 01:10 diluição da cultura começou na etapa 2.14. Dilua as células em 5 mL de LB mídia para uma OD600 de 0,01. Despeje em um reservatório. Adicione 80 µ l de células diluídas para as diluições linear de drogas preparadas na etapa 3.6 utilizando uma micropipeta multicanal. As concentrações de droga final em cada poço é mostrado na Figura 7B.Nota: O meio bem na dose-resposta receberá o serial IC50 para esta droga. A placa do selo para evitar a evaporação. Incubar a placa para 16 h a 37 ° C. Começa duas culturas bacterianas frescas para usar na etapa 4 (repita etapas 1.5-1.7). 4. experimento de interação droga diagonal Medir a absorvância de600 OD por diluição linear dose-resposta de etapa 3 (Figura 7B). Para cada droga, escolha a concentração que resultaram em IC50 e prepara droga LEV, NAL e PNG em 100 x IC50 concentrações. Descongelar as drogas frescas, preparar 100 x IC50 para cada droga e preparar misturas de drogas de 1:1 em volume de LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e 1: mistura de droga de 1:1 em volume de LEV + NAL + PNG. Prepare duas placas para experiências de interação de droga como mostrado na Figura 8. Medir o OD600 das 01:10 diluição das culturas começou na etapa 3.11. Preparar OD600 = 0,01 diluições de duas culturas em duas 10 mL de LB mídia. Adicione 80 µ l de células da cultura 1 e 2 em placas 1 e 2, respectivamente. Sele as placas para evitar a evaporação. Incubar as placas durante 16 h a 37 ° C. 5. golo de interação droga diagonal Medida da absorvância de600 OD para interação medicamentosa diagonal experimentar pratos da etapa 4. Normalize o crescimento, dividindo-se o crescimento em cada poço, com o crescimento no controle de drogas não bem para cada linha. Para cada linha, localize a coluna que tem mais próximo de IC50, mostrado em laranja na Figura 8 certa inibição do crescimento. Atribua o IC50 baseada a concentração relativa de droga nesta bem. Para LEV + NAL, NAL + PNG e LEV + NAL + PNG dose-respostas e LEV + PNG, calcule IC50 esperado calculando o IC50 das drogas em cada combinação única. Observe que em média é uma aproximação simples para cálculo exato de IC50 esperado conforme descrito antes12. Calcule o golo de concentração inibitória fracional (FIC), dividindo o IC50 observados pelo IC50 esperada em cada combinação.

Representative Results

Anteriormente, informamos as interações emparelhadas entre três drogas: LEV, NAL e PNG com base em testes em ensaios miniaturizados quadriculado, onde duas drogas foram combinadas em uma matriz 4 x 413,14. Enquanto NAL e LEV foram sinérgicos, PNG foi relatado para ser antagônico com tanto LEV e NAL de13,14. Aqui, verificamos essas interações emparelhadas e medido a interação de três vias entre estas três drogas usando um ensaio diagonal. Nossos resultados demonstram que o LEV + NAL + PNG é uma combinação sinérgica de antibiótica 3 vias. Representações esquemáticas para os resultados das seções individuais procedimento experimental foram dadas no lado direito da Figura 7 e Figura 8. Aqui, apresentamos e interpretar resultados brutos representativos de três leituras de placa, que são dadas na Figura 9. A leitura da placa superior corresponde à diluição serial e linear experimentos conduzidos em etapas 2 e 3. As duas leituras de placa inferior são placas duplicadas interação realizadas na etapa 4. Os dados brutos na Figura 9 mostram que crescimento superior é em torno de 0,55, mas há uma densidade óptica 0,05 da mídia em si, como observado no OD600 das concentrações alta drogas onde não há nenhum crescimento. Portanto, definimos IC50 como (0.55-0.05)/2 = 0,25. Para cada dose-resposta, os poços localizados mais próximo a este valor são mostrados com laranja. A metade superior da Figura 9A mostra os resultados da etapa 2, experimento serial dose-resposta. Os poços de IC50 para LEV é em repetições de 10 em duas colunas, que correspondem a 4 ng/mL. O IC50 para NAL e PNG estão a 3 µ g/mL e 25 µ g/mL, respectivamente. Essas concentrações correspondem à concentração de 1 x indicado na Figura 7B. A metade inferior da Figura 9B mostra os resultados da etapa 3, experimentos dose-resposta linear. LEV, NAL e IC50 do PNG encontram-se em 0,4 x, x 0.8 e 1.2 x, respectivamente. Essas concentrações são atribuídas como o 1 X IC50 para etapa 4. Duas placas correspondente ao replicar dois experimentos são mostrados na Figura 9B, onde o IC50 poços são mostradas com laranja. Em chapa de 1, todos os medicamentos simples têm seu IC50 na concentração de 1 x. O IC50 esperados para a combinação de emparelhadas ou ménage é calculado pela média aritmética das drogas constituintes, tornando IC50 esperado para concentração de 1x também todas as combinações. Em chapa 2, LEV e PNG têm seu IC50 na concentração 1 x, mas NAL IC50 é de 1.2 x. O IC50 esperados para cada combinação é definida utilizando a média aritmética destes valores de IC50. Por exemplo, o esperado IC50 para LEV + NAL e NAL + PNG é 1.1 x. A interação de droga marcar (FIC) para cada combinação é calculada dividindo-se observado IC50 com o IC50 esperados, como mostrado no lado direito das placas. Inspeção das pontuações das duas placas FIC demonstra que LEV + NAL e LEV + NAL + PNG são sinérgicas, enquanto LEV + PNG e NAL + PNG são antagônicas. FIC somatória de pontos atribuídas as duas placas está de acordo, a confiabilidade do protocolo de apoio. Figura 1: Null definição de modelo para modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. 5 x duas 5 matrizes em uma microplaca, onde drogas A linearmente é aumentada em um eixo, como mostrado à esquerda, e uma alta concentração de fármaco inibe um fenótipo quantificável (superior direito). A adição destas matrizes é mostrada no meio, onde as linhas conectando equipotent droga um concentrações em cada única droga tem a mesma concentração que droga A. Quando as células são adicionadas a este “tabuleiro de damas” de combinações de concentração de drogas, espera-se que o fenótipo gravado nesta linha será equivalente para os poços que se conecta. Neste experimento de interação droga autoauto, o isobole representando um fenótipo (mostrado com uma linha tracejada verde) é esperado para ser linear, definindo o modelo de aditividade nula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: interações de droga emparelhadas, de acordo com o modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. Quando dois medicamentos são combinados em um ensaio de xadrez, como na Figura 1, o contorno de isophenotypic observado pode ser em linha reta, convexa ou côncava. À direita, isophenotypic possíveis contornos (linhas tracejadas verdes) são sobrepostos em ensaios de tabuleiro de damas. Combinações de drogas com contornos isophenotypic reta são Loewe-aditivo, como os contornos não são diferentes de uma interação de droga autoauto, que é a Loewe-aditivo por definição. Quando o contorno de isophenotypic significativamente é côncavo ou convexo, a combinação é sinérgica ou antagônica, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: interações medicamentosas de três vias de acordo com o modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. Semelhante para o ensaio de quadriculado para interações emparelhadas, três-drogas são combinadas em uma grade 3D (um “checkercube”), onde cada droga linearmente é aumentada em um eixo. Se as três drogas eram idênticas, isophenotypic superfície deve ser plana, definindo a aditividade para três combinações de drogas. Se a superfície é mais côncava ou convexa que este modelo nulo Loewe-aditivo, combinações de drogas são sinérgicas ou antagônicas, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: método Diagonal para medir interações medicamentosas emparelhadas. Para cada ensaio de tabuleiro de damas, medem-se apenas as regiões mostradas em retângulos magenta. i e ii são linearmente única droga concentrações crescentes. III é avaliada, fazendo uma mistura 1:1 de dois medicamentos e linearmente titulada esta mistura como se fosse uma única droga. A FIC é igual ao IC50 observados na combinação dividida pelo esperado IC50 de duas drogas única. Para o modelo de aditividade de Loewe, o esperado IC50 é aproximada pelo IC50 média das duas drogas única. Um valor FIC é 1 para pares de Loewe-aditivo e é inferior ou superior a 1 para os pares sinérgicas ou antagônicas, respectivamente2,12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: método Diagonal para medir interações medicamentosas ménage. Para cada ensaio de checkercube, apenas as regiões mostradas são medidas. i, ii e iii são linearmente única droga concentrações crescentes. IV é medido por fazendo um 1:1:1 mistura de três drogas e linearmente titulada esta mistura como se fosse uma única droga. A concentração inibitória fracional é igual ao observado IC50 na combinação dividida pelo IC50 esperado dado três drogas única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: fluxo de trabalho para o protocolo do método diagonal aqui descritos e os detalhes de configuração para cada microplacas. A placa mostrada no dia 4 é conduzida em duplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: experimentos dose-resposta de diluição Serial e linear. (A) preparação da diluição serial dose-resposta para uma droga e concentrações de droga final correspondente. Células de Escherichia coli são adicionadas à placa; crescimento é gravado após 16 h. IC50 Serial, mostrado em laranja, é selecionado para cada droga para uso no dia seguinte é linear experimentos dose-resposta de diluição. (B) preparação da diluição linear dose-resposta para uma droga e concentrações de droga final correspondente. Células de Escherichia coli são adicionadas à placa; crescimento é registrado após 16 h. Para cada droga, o selecionado IC50s que será usado do dia seguinte drogas interação experimentos são mostrados em laranja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: experiências de interação de drogas. Preparação de experiências de interação é a única droga linear dose-respostas semelhantes, exceto que um 1:1 ou 1:1:1 mistura de drogas é usada para dois ou três droga dose-respostas, respectivamente. Observada IC50s para cada dose-resposta, retratado em laranja, são usados para calcular o golo de FIC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: representante experimentar resultados. São mostrados resultados representativos obtidos usando o protocolo descrito, com pormenores fornecidos no texto principal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O uso de combinações de drogas contra patógenos ou tumores é uma perspectiva atraente, especialmente sob as circunstâncias de antibiótico pipeline de secagem. No entanto, este potencial é dificultado pelo menos duas dificuldades. A primeira dificuldade é o número astronômico de combinações possíveis. Existem, por exemplo, 4950 combinações possíveis de pares entre 100 antibióticos. Todas as combinações possíveis entre 100 antibióticos (2100) está na mesma ordem de magnitude, com o número de bactérias na terra (10 ~30). Como prever combinações fortemente sinérgicas entre essas possibilidades tem sido objecto de numerosos estudos computacionais. A segunda dificuldade é a medição de interações medicamentosas de alta ordem. Considere que uma plataforma computacional pode sugerir que uma determinada combinação de droga-10 é fortemente sinérgica contra um determinado patógeno. Métodos tradicionais para testar interações medicamentosas é demasiado onerosa para verificar ou refutar esta hipótese, portanto, o estudo da sinergia entre muitos medicamentos tem sido fora dos limites da investigação científica. O método diagonal, o que foi proposto pela primeira vez há quase 30 anos e foi usado em algumas telas de sinergia recentes fornecem uma base sólida para o primeiro problema, permitindo o teste da interação entre muitos pares. Ele resolve o problema segundo uma amostragem informativa dos ensaios tradicionais e permite o estudo das interações medicamentosas de alta ordem.

Importante notamos que nosso protocolo usa uma dosagem linear para medições de interação de drogas, para fornecer a sensibilidade para detectar até mesmo interações fracas. Estabelecer o intervalo de concentração certa para dosagem linear é uma tarefa desafiadora. Realizando primeiro uma diluição serial, podemos tomar uma decisão informada sobre o espaço de busca para dosagem linear. No entanto, o protocolo pode ser modificado para usar 2 dobras ou maiores diluições em série para testes de interação de drogas. Essa modificação pode encurtar o tempo de experiência e permitem que o teste de interações mais; no entanto, teria sensibilidade para detectar interações apenas fortemente sinérgicas ou antagônicas.

O protocolo descrito mostra a medição de interações emparelhadas ou três vias. Um aspecto importante do protocolo é que agentes único são no mesmo prato como a combinação, para minimizar o viés devido às variações do prato. Portanto, o protocolo pode ser ajustado para medir interações até 7 vias combinações por modificações triviais. Combinações de mais de 7 drogas vão exigir mais de uma microplaca de 96 poços e considerações adicionais devem ser tomadas para garantir a integração de dados corretos, tais como repetições inter plate.

Uma notável limitação do método diagonal é a restrição que cada droga no ensaio deve inibir o fenótipo de interesse. Portanto, o método diagonal não é útil para a compreensão das interacções entre agentes ativos e adjuvantes inertes. Tais interações ‘potencializadora’ podem ser estudadas sob modelos alternativos tais como modelos de felicidade ou maior agente único.

Uma consideração importante para a análise de interações medicamentosas de ordem superior é a escolha do modelo nulo para o “IC50 esperado.” Quando duas drogas são combinadas, o efeito da combinação só pode ser comparado aos efeitos da droga. Quando três drogas são combinadas, o efeito da combinação pode ser comparado ao único efeitos ou efeitos emparelhados. Por exemplo, se todas as combinações emparelhadas de três drogas são sinérgicas, então ser de esperar que estas drogas mostrará uma sinergia de três vias. Desvio de uma interação três vias do que é esperado de interações emparelhadas foi recentemente apelidado “interação emergente”16,17. Para simplificar, nosso protocolo descreve a medição da combinação de três vias está “líquido interação,” que define o modelo nulo como efeitos de droga. No entanto, os dados que são obtidos a partir do protocolo também podem ser usados para calcular a interação emergente da combinação de três vias. Em nossa análise, definimos o esperado IC50 da combinação de três vias como a média da única droga IC50s. Alternativamente, o IC50 esperado pode ser definido como a média da IC50s de combinações emparelhadas (~1.1-1.2). Quando o IC50 observada é dividido por esta alternativa IC50 esperado, o FIC obtido fornece o FIC emergente para a combinação de três vias, como descrito anteriormente,12. Esta consideração revela que LEV + NAL + PNG é sinérgica mais do que o que seria de esperar de emparelhadas interações entre três drogas, demonstrando que o LEV + NAL + PNG tem sinergia emergente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIGMS Grant P50GM107618. Os autores agradecer Zohar B. Weinstein para as observações perspicazes e sugestões sobre o manuscrito.

Materials

1.5 mL Semi Micro Cuvette  VWR 97000-586
1.5 mL  Eppendorf Microcentrifuge Tubes USA Scientific 4036-3204
1000 µL Tips Geneseesci 24830
14 mL Breathable Cell Culture Tube VWR 60819-761
20 µL Tips Geneseesci 24804
200 µL Tips Geneseesci 24815
37 °C Incubator Panasonic MIR-262-PA
37 °C Shaker Incubator Thermo Scientific SHKE8000
5 mL Cell Culture Serological Pipette VWR 53300-421
96-well Microplates VWR 15705-066
Breathable Sealing Film USA Scientific 2920-0010
DMSO Sigma 41647
Escherichia coli ATCC 700926
Glycerol Sigma G9012
LB Broth Powder RPI L24065
Levofloxacin Sigma 28266
Micropipette GILSON PIPETMAN Classic
Microplate reader BioTek Synergy H1
Multichannel micropipette VistaLab 1060
Nalidixic acid Sigma N8878
Penicillin G Sigma P3032
Pipette Pump Drummond  4-000-501
Reagent Reservoir VWR 89094-658
Spectrophotometer BIO-RAD 1702525
Vortex Mixer Fisher Scientific 10-320-807
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References

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Cokol-Cakmak, M., Bakan, F., Cetiner, S., Cokol, M. Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs. J. Vis. Exp. (136), e57713, doi:10.3791/57713 (2018).
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