النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الخلايا المناعية جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الكولاجين (3D) ثلاثي الأبعاد باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. ويفصل هذا البروتوكول أيضا كيفية تعقب الهجرة الخلية في 3D. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.
Abstract
في فيفووالتنشيط وانتشار ووظيفة كل الخلايا المناعية تحدث في بيئة (3D) ثلاثي الأبعاد، على سبيل المثال في الغدد الليمفاوية أو الأنسجة. حتى الآن، تعتمد معظم أنظمة في المختبر على ثنائي الأبعاد (2D) السطوح، مثل لوحات زراعة الخلايا أو كوفيرسليبس. لتقليد أمثل الظروف الفسيولوجية في المختبر، فنحن نستخدم مصفوفة الكولاجين 3D بسيطة. الكولاجين هو أحد المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وقد استخدمت على نطاق واسع لتشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. لتصوير ثلاثي الأبعاد، ظهرت التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) مع اكتساب عالية السرعة وعمق اختراق كبير وتبيض منخفضة وفوتوسيتوتوكسيسيتي. وعلاوة على ذلك، ورقة الخفيفة الميكروسكوب مفيد خاصة لقياس المدى الطويل. هنا يصف لنا بروتوكولا أمثل كيفية إعداد والتعامل مع الخلايا المناعية البشرية، مثل الابتدائي البشرية السامة للخلايا T لمفاوية (CTL) وخلايا القاتل الطبيعي (ناغورني كاراباخ) في المصفوفة الكولاجين 3D للاستخدام مع ورقة الضوء مجهرية لتصوير الخلايا الحية و نماذج ثابتة. وترد الإجراءات المتعلقة بالحصول على الصور وتحليل الهجرة الخلية. ويرد تركيز بصفة خاصة لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة وعوامل لإعداد العينات وتحليل البيانات. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة الكولاجين ثلاثي الأبعاد، ولا يقتصر على الخلايا المناعية.
Introduction
معظم المعارف حول ترحيل الخلايا يأتي من تجارب 2D1،2،3، التي تجري عادة في الزجاج أو سطح البلاستيك الثقافة/التصوير الطبق. ومع ذلك، يتطلب سيناريو فسيولوجية، في معظم الحالات، المكروية 3D، الذي المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دوراً حاسما. إدارة المحتوى في المؤسسة ليس فقط يوفر هيكل ثلاثي الأبعاد الأساسية للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا السليمة ولكن يقدم أيضا إشارات البقاء على قيد الحياة أو إشارات الاتجاه الأداء الأمثل للعديد من الخلايا4،5 . ولذلك، مطلوب بيئة ثلاثية الأبعاد تحديد أفضل الوظائف الخلوية والسلوك في بيئة أفضل مما يعكس السياق الفسيولوجية.
في الجسم البشري، ومعظم الخلايا خاصة الخلايا المناعية، ممارسة وظائفهم بموجب سيناريو 3D. على سبيل المثال، تنشيط خلايا تي دوريات الأنسجة البحث عن الخلايا الهدف، وترحيل السذاجة تي الخلايا عن طريق الغدد الليمفاوية في البحث عن خلاياها المشابهة مستضد-عرض خلالها وضع الهجرة والآلات يتم تكييفها للمقابلة خارج الخلية البيئة3،،من67. جل الكولاجين 3D قد استخدمت على نطاق واسع كخلية 3D راسخة وجيدة تتسم ثقافة نظام8،9،10. أعمالنا السابقة يظهر أن الخلايا الليمفاوية البشرية الأولية كثيري التنقل والهجرة بسرعة متوسط من حوالي 4.8 ميكرومتر/دقيقة في مصفوفة المستندة إلى الكولاجين 0.25%11. إعادة ترتيب cytoskeleton دوراً رئيسيا في هجرة الخلية12. تتراكم الأدلة تبين أن الخلايا الليمفاوية لا تنطبق إلا في وضع واحد للهجرة حتى الآن يمكنك التبديل بين سلوك معين الهجرة اعتماداً الموقع، المكروية، السيتوكينات، والتدرجات chemotactic، وخارج الخلية الإشارات التي تصل قيمتها المهاجرة من السلوك في طرق مختلفة 3.
لتحليل موثوق وظائف الخلايا المناعية والسلوك، على سبيل المثال، الهجرة، وتشكيل نتوء أو النقل حويصلية، أنها ميزة كبيرة لتكون قادرة على الحصول على الصور بأحجام كبيرة نسبيا 3D بطريقة سريعة وموثوق بها. ويوفر التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) لتصوير ثلاثي الأبعاد،13،حل مرض14. أثناء التصوير اقتناء، يتم إنشاء ورقة خفيفة ثابتة رقيقة لإلقاء الضوء على العينة. وبهذه الطريقة، على متن الطائرة التركيز، يمكن مضيئة مساحة كبيرة في وقت واحد دون التأثير على الخلايا خارج الطائرة. تمكن هذه الميزة بسرعة اقتناء عالية مع انخفاض شديد تبيض وفوتوسيتوتوكسيسيتي. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تصور الخلايا المناعية البشرية الأولية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري وكيفية تحليل الهجرة في سيناريو 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنفذ معظم فحوصات في المختبر على سطح ثنائي الأبعاد، على سبيل المثال في خلية ثقافة لوحات، أطباق بتري، أو في كوفيرسليبس، بينما في فيفو الخلايا، لا سيما الخلايا المناعية، تجربة معظمه المكروية 3D. ظهور أدلة تبين أن أنماط الهجرة من الخلايا المناعية تختلف بين 2D و 3D سيناريوهات17…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر معهد “هيموستاسيولوجي السريرية” والطب نقل الدم لتقديم التبرع بالدم؛ كارمن Hässig وكورا خوجا للحصول على مساعدة تقنية ممتازة. ونحن نشكر ينس رتيغ (جامعة سارلاند) لناقل بماكس المعدلة، رولاند ويدليتش-المرتزقة (جامعة موينستر) لبناء ليفيكت-روبي الأصلي، وكريستيان يونكر (جامعة سارلاند) لتوليد بنية ليفيكت-ميجفب. مولت هذا المشروع سونديرفورشونجسبيريتش 1027 (المشروع A2 إلى B.Q.) و 894 (المشروع A1 إلى M.H.). مجهر الضوء-ورقة كانت تمولها DFG (GZ: فوغ أنست 256/4 19-1).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
