ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs
Summary
Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.
Abstract
תרגום חניכה היא הצעד הגבלת קצב של סינתזת חלבונים והוא מייצג נקודת מפתח שבה תאים לווסת את תפוקתן חלבון. רגולציה של סינתזת חלבונים היא המפתח מתח-תגובת תאי ולאחר dysregulation מקום מרכזי מדינות למחלות רבות, כגון סרטן. למשל, למרות מתח סלולארית מובילה עיכוב של תרגום הכללית על ידי חניכה תלויי-כיפה attenuating, חלבונים מסוימים הלחץ-תגובה סלקטיבית מתורגמים באופן שאינו תלוי-קאפ. דיסקרטי רכיבים רגולטוריות RNA, כגון אתרים כניסה הסלולר ריבוזום פנימית (IRESes), מאפשרים התרגום של אלה mRNAs ספציפיים. זיהוי של mRNAs כזה, אפיון מנגנוני הרגולציה שלהם, היה אזור מפתח בביולוגיה מולקולרית. Toeprinting היא שיטת המחקר של RNA מבנה ותפקוד כפי שהוא נוגע תרגום חניכה. המטרה של toeprinting היא להעריך את היכולת של במבחנה עיבד RNA ליצירת קומפלקסים יציבים עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים מעורבים ריבוזום איגוד — שלפני הסמן לטקס החניכה תרגום יעיל. לצד טכניקות אחרות, כגון ניתוח המערב והגדרת פרופיל polysome, toeprinting מאפשרת אפיון חזקים של מנגנוני ויסות תרגום חניכה.
Introduction
כמו תרגום צורכת אנרגיה תאית ביותר, זה הגיוני כי התרגום הוא מוסדר בחזקה1. לעומת זאת, dysregulation של תרגום- והשינויים הסוגר בפלט חלבון-נצפית לעיתים קרובות במצבי סטרס-תגובה ומחלות, כגון סרטן1,2. היתרון העיקרי של שליטה translational הוא המהירות שבה תאים יכולים לשנות תפוקתן חלבון על מנת להגיב לגירויים שונים3. תרגום תקנה ובכך מייצג מנגנון חשוב זה יכול להשפיע על הישרדות cell ומוות1,2,3. השלבים של תרגום, חניכה הוא רוב מוסדר ומורכבות מאוד3. בקצרה, mRNAs האיקריוטיים להכיל 5′ m7G כובע חיונית כמעט תמיד את התרגום שלהם. תלוי cap-חניכה דורש חניכה האיקריוטים גורמים eIF4E, eIF4A ו- eIF4G (cap-זיהוי המתחם) כדי לקיים אינטראקציה עם תום 5′ של mRNA. 43S preinitiation הריבוזום מורכב, המכיל eIF2 מכורך יוזם tRNA, eIF3, הוא גויס לסוף 5′ ה-mRNA דרך אינטראקציה של eIF4G עם eIF3. Preinitiation מורכבים נחשב לסרוק mRNA, שנעזר eIF4A (הליקאז RNA) עד codon ההתחלה (אוגוסט) ממוקם. לאחר מכן נוצרת הקבלה 48S מורכבים, סינתזת מועבר לתוך P-האתר של הריבוזום. בסופו של דבר, subunits ריבוזום בשנות ה-60 וה -40 מאוחדים כדי ליצור את ה-80 חניכה מורכב, ואחריו תרגום התארכות1,3,4. לעומת זאת, אתרים כניסה ריבוזום פנימית (IRESes) לעקוף את הדרישה כובע 5′ על-ידי גיוס של יחידת משנה ribosomal ישירות אל codon חניכה3בשנות ה-40. מצבים פיזיולוגיים מתח להחליש הכללית תרגום mRNA בשל שינויים גורמי מפתח חניכה האיקריוטים כללי (eIFs). עם זאת, התרגום קאנונית חניכה מאפשרים לתרגום סלקטיבי של mRNAs מסוימים, אשר לעיתים קרובות לקודד את תגובת המתח חלבונים ולאחר dysregulation של תרגום קאנונית החניכה הייתה שם במדינות מחלות כמו סרטן 1 , 2. רכיבים רגולטוריות RNA דיסקרטי, כגון IRESes הסלולר, לאפשר התרגום של כזה2,mRNAs3.
היבט מעניין במיוחד אחד של שליטה translational היא להבין מנגנונים של הקנוני לעומת תרגום קאנונית mRNA נתון. Toeprinting היא טכניקה המאפשרת המחקר מכניסטית מפורט חניכה תרגום RNAs ספציפיים בתוך חוץ גופית. המטרה הכוללת של toeprinting הוא להעריך את היכולת של RNA עניין nucleate את היווצרות חניכה תרגום מורכב עם הריבוזום תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים נדרשים עבור תרגום יעיל חניכה. למשל, גיוס ריבוזום אולי הפריע בהיעדרו של כובע 5′ אבל מגורה על ידי נוכחות IRES.
העקרון של השיטה היא במבחנה לתמלל של RNA של עניין, דגירה זה בנוכחות הסלולר תמציות המכילות רכיבים תרגום (או הרכיבים מטוהרים) כדי לאפשר חניכה מתחמי לטופס, וכדי להפוך לתמלל הרנ א עם פריימר ספציפיים. מתחמי RNA-ריבוזום יציב יגרום שעתוק במהופך לעכב בקצה 3′ של הריבוזום-מה שנקרא ‘toeprint’5,6,7.
ב פרוטוקול זה, ribosomal subunits, eIFs, tRNAs, ו IRES הטרנס-משחק גורמים (ITAFs) נתרמים בנוחות על ידי ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה). יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של פריימר fluorescently התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מבוסס על ג’ל imager, ולא פריימר radiolabeled. פעולה זו מבטלת צעדים נוספים, כולל radiolabeling הראשיים, כמו גם ייבוש הג’ל, לחשוף אותה למסך מעצימה. הלהקות פלורסנט נרשמים בזמן אמת, כמו שלשול ג’ל, המאפשרות ברזולוציה גדולה יותר. Uncapped X-linked המדכא של אפופטוזיס חלבון (XIAP) IRES RNA משמשת כדוגמה כאן, למרות mRNAs רצ’ט ניתן לנתח גם על-ידי טכניקה זו8.
בניגוד לניתוח המערבי, אשר מודד את הפלט הסופי של תהליך התרגום בתא lysates, toeprinting היא גישה במבחנה כדי למדוד את התרגום חניכה היווצרות מורכבות על RNA. גישה זו רדיוקציוניסטי מאפשרת לצורך המחקר ומפורט של סובסטרטים או גורמים המסדירים תרגום חניכה (למשל., רצ’ט או משולחים שאינם רצ’ט mRNA, IRES מבנה, נוכחות או היעדרות של זנב poly-A, אספקת חלבון ספציפי גורמים, וכו.). לפיכך, toeprinting ניתן ללמוד מצבים שונים של תרגום8 או ההשפעות של מבנים mRNA, כגון IRESes,9,של סינתזת חלבון10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting היא טכניקה חזקה למדוד ישירות את היכולת של RNA עניין לתמוך היווצרות של תרגום מתחמי חניכה בנסיבות מבוקרת מאוד. פרוטוקול זה מתאר טכניקה פשוטה עבור toeprinting RNAs יונקים. ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה) משמש כמקור נוח של הריבוזומים, eIFs, יוזם tRNA, IRES הטרנס-מתנהג גורמים (ITAFs). הנסיין מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה במימון של מדעי הטבע, מחקר המועצה של קנדה-גילוי הנדסית (RGPIN-2017-05463), קרן קנדה חדשנות-ג’ון ר אוונס מנהיגים קרן (35017), התוכנית מחדשת הקמפוס אלברטה, אלברטה משרד סחר ופיתוח כלכלי.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
