Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.
Abstract
Para identificar el papel de una subpoblación de neuronas en el comportamiento, es esencial para poner a prueba las consecuencias de bloquear su actividad en animales vivos. Ablación láser de las neuronas es un método eficaz para este propósito cuando las neuronas son selectivamente marcadas con sondas fluorescentes. En el presente estudio, se describen los protocolos para láser ablación una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones y la prueba de sus consecuencias funcionales y conductuales. En este estudio, el comportamiento de captura de presas en las larvas de pez cebra se utiliza como un modelo de estudio. El circuito hipotalámico pretecto se conoce para ser la base de esta presa visualmente impulsado por captura de comportamiento. Pez cebra pretectum fue quitado por ablación láser, y la actividad neuronal en el lóbulo inferior del hipotálamo (ILH; el objetivo de la proyección pretectal) fue examinada. Comportamiento de captura de presas después de la ablación pretectal también fue probado.
Introduction
Para entender cómo el comportamiento surge de la actividad neuronal en el cerebro, es necesario identificar los circuitos neuronales que intervienen en la generación de ese comportamiento. En la etapa larval, el pez cebra proporciona un modelo animal ideal para estudiar la función cerebral asociado con el comportamiento porque sus cerebros pequeños, transparentes permiten investigar la actividad neuronal en una resolución de celular en una zona amplia de la cerebro mientras observa el comportamiento1. Proyección de imagen de la actividad neuronal en las neuronas específicas ha sido posible a través de la invención de indicadores genético codificados calcio (Ca) (GECIs) como GCaMP2. Pez cebra transgénico GCaMP han demostrado para ser útiles para asociar el circuito neuronal funcional con un comportamiento mediante la realización de proyección de imagen de Ca en comportamiento de animales3.
Mientras que la proyección de imagen de Ca puede demostrar las correlaciones entre la actividad neuronal y el comportamiento, para demostrar causalidad, supresión de la actividad neuronal y su consequence(s) sobre el comportamiento de la prueba son pasos importantes. Hay varias maneras de lograrlo: uso de la mutación genética que altera circuitos neurales específicos4, expresión de neurotoxinas en neuronas específicas5,6, uso de herramientas optogenetic como halorodopsina7, y laser de ablación de las neuronas específicas8,9. Ablación láser es especialmente adecuada para la eliminación de la actividad en un número relativamente pequeño de neuronas específicas. Eliminación irreversible de la actividad neuronal matando neuronas facilita la evaluación de consecuencias conductuales.
Un comportamiento interesante que se puede observar en la etapa larval en el pez cebra es la captura de presas (figura 1A). Este comportamiento guiado visualmente, intencionadas ofrece un favorable sistema experimental para el estudio de la agudeza visual10, transformación visuomotor11,12,13, percepción visual y reconocimiento de objetos14,15,16,17,18y19de la toma de decisiones. Cómo presa es reconocida por depredadores y cómo detección de presa lleva a la presa catching comportamiento ha sido una cuestión central en Neuroetología20. En este artículo, nos centramos en el papel del circuito hipotalámico pretecto formado por proyecciones de un núcleo en el pretectum (núcleo pretectalis superficialis equipara magnocellularis, en adelante, simplemente observado como el pretectum) al ILH. Ablación del laser del pretectum fue demostrada para reducir la actividad de captura de presas y suprimen la actividad neuronal en el ILH asociado a la percepción visual de la presa del21. Aquí, los protocolos para la realización de láser ablación y probar su efecto en Ca2 + la proyección de imagen y grabación de comportamiento describen a las larvas de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el régimen de dos fotones láser tiene una excelente resolución espacial a ablar específicamente las neuronas individuales, gran debe tener precaución para evitar daños no deseados en el tejido cerebral debido a la calor. El paso más importante en el experimento de ablación es determinar la cantidad óptima de la irradiación del laser. Insuficiente irradiación no mata a las neuronas. Demasiada irradiación será daño por calor el tejido circundante, que darán lugar a efectos no deseados. El rango óptim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estos estudios fueron financiados por subvenciones recibidas del MEXT, JSP KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 y JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
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