העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות
Summary
כאן נתאר פרוטוקול על יצירה וערבה culturing האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי (3D) קיבה organoids, ואת שיטת להעברת organoids תלת-ממד טפט 2-ממדי. השימוש טפט אפיתל הקיבה כמו assay הרומן פצע שריטה ללימודי התחדשות גם מתואר.
Abstract
מחקרים במבחנה של הפצע קיבה תיקון בדרך כלל כרוכה בשימוש של שורות תאים סרטן קיבה ב וזמינותו פצע שריטה של התפשטות תאי והעברה. מגבלה קריטית אחת של מבחני כזה, זאת, מבחר סוגי הסלולר הומוגני שלהם. תיקון הוא תהליך מורכב אשר דורש את האינטראקציה של מספר סוגי תאים. לכן, ללמוד תרבות ללא יחוברו הסלולר, היא דאגה שחייבים להכריעו אם ברצוננו להבין את תהליך התיקון. המודל תא צורב קיבה עשויה להקל על הבעיה לפיה האוסף הטרוגנית של סוגי תאים מקרוב משקף של האפיתל קיבה או אחרים רקמות מקורי בתוך vivo. הפגינו כאן הוא רומן, במבחנה פצע שריטה assay נגזר מן האדם או בעכבר organoids תלת-ממדי אשר אז ניתן להעביר טפט אפיתל הקיבה כמו גם organoids שלמים או השעיה תא בודד של חלופה מועדפת organoids. המטרה של הפרוטוקול היא להקים תא צורב-derived קיבה אפיתל monolayers יכול לשמש במערכת assay פצע שריטה הרומן ללמוד התחדשות קיבה.
Introduction
השימוש של מבחני פצע שריטה היא שיטה פופולרית לימוד תיקון והתחדשות1,2,3,4,5,6. המתודולוגיה המוצעת עשוי לשמש ללמוד במיוחד התחדשות קיבה ו קולוניזציה הליקובקטר פילורי . בעבר, שורות תאים סרטן קיבה שימשו כאמצעי ללמוד הליקובקטר פילורי (ח פילורי) זיהום1,2 , עד סרטן קיבה לאחרונה היו שורות תאים כגון תאים AGS המועדף1 ,2,3,4. מגבלה אחת של תרביות תאים סרטן הקיבה היא כשל שלהם כדי לסכם את הגיוון הסלולר של האפיתל קיבה. כדי לנסות לטפל מגבלה זו, הדגים שהנה הממסד ואת ההעברה של ראשי האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי fundic קיבה organoids (FGOs) אפיתל חד שכבתי קיבה עבור מבחני ריפוי הפצע המבוסס על שיטה שונה קודם שתואר על ידי Schlaermann et al. 7 נדגים כי monolayers אפיתל הקיבה נגזר לכסנתם FGOs קיבה תלת-ממד או תאים בודדים נגזר FGO שומרים על קומפוזיציה הסלולר מקוטב המייצג בצורה הקרובה של האפיתל קיבה ויוו. בהתחשב בכך שורות תאים סרטן קיבה לא מפגינים את ההרכב תא שטכניקה זו מציגה הפרוטוקול הנוכחי יש יתרון על פני שיטות אלטרנטיבית assay שריטה-פצע. מתודולוגיה זו מוטבה לפיה monolayers יכול להיות הוקמה כל organoids או השעיה תא בודד מן organoids הפומבית, מצופה שימוש במטריצה קרום המרתף או ציפוי קולגן. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור שתא צורב נגזר תרבויות קיבה אפיתל חד שכבתי assay הריפוי הפצע הרומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי מפרט הקמתה של האדם ואת העכבר-נגזר קיבה אפיתל monolayers יכול לשמש עבור מבחני שריטה-פצע. הפרוטוקול תלוי המושג תושב תאי בידוד האדם הראשי (או עכבר) ברקמות, פרוטוקול ששונה מתפרסם לראשונה על ידי Schlaermann et al7. בפרט, יש אופטימיזציה פרוטוקול כאן להקים confluent ואנו מקוטב טפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 הענק (yz ימאהה).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
