DNA regelgevende elementen, zoals versterkers, kwaliteitsbeheersing genexpressie door fysiek contact met target gene initiatiefnemers, vaak door middel van lange-afstands chromosomale interacties verspreid over grote genomic afstanden. Promotor vangen Hi-C (PCHi-C) identificeert belangrijke interacties tussen initiatiefnemers en distale regio’s, waardoor de toewijzing van potentiële regulerende sequenties aan hun doelgenen.
De driedimensionale organisatie van het genoom is gekoppeld aan de functie. Bijvoorbeeld, controle regelgevende elementen zoals de versterkers van de transcriptionele de spatio-temporele uitdrukking van hun doelgenen door middel van fysiek contact, vaak aanzienlijke (in sommige gevallen honderden van kilobases) genomic afstanden te overbruggen en omzeilen nabijgelegen genen. Het menselijk genoom herbergt een geschatte één miljoen enhancers, waarvan de overgrote meerderheid hebben onbekende gene doelen. Distale regelgevende gebieden toe te wijzen aan hun doelgenen is dus van cruciaal belang te begrijpen gen expressie controle. We ontwikkeld promotor vangen Hi-C (PCHi-C) de genoom-brede detectie van distale promotor-interactie regio’s (PIRs), inschakelen voor alle initiatiefnemers in een enkele experiment. In PCHi-C, zijn zeer complexe Hi-C bibliotheken speciaal verrijkt voor promotor sequenties via in-oplossing hybride selectie met duizenden biotinyleerd RNA lokaas complementair aan de uiteinden van alle promotor-bevattende beperkingsfragmenten. Het doel is om vervolgens pull-down promotor sequenties en hun frequente interactie partners zoals smaakversterkers en andere potentiële regelgevende elementen. Na hoge gegevensdoorvoer gekoppeld-einde sequencing, wordt een statistische toets toegepast op elke promotor-afgebonden beperking fragment te identificeren aanzienlijk PIRs op het beperkingsniveau fragment. PCHi-C hebben we gebruikt voor het genereren van een atlas van lange-afstands promotor interacties in tientallen mens en muis celtypes. Deze promotor interactome kaarten hebben bijgedragen tot een beter begrip van bij zoogdiercellen expressie controle door het toewijzen van vermeende regelgevende gebieden aan hun doelgenen en onthullend preferentiële ruimtelijke promotor-promotor interactienetwerken. Deze informatie is ook groot belang aan het begrip van genetische ziekten bij de mens en de identificatie van potentiële ziekte genen, door het koppelen van niet-coderende ziekte-geassocieerde volgorde van varianten in of nabij besturingsprocessen aan hun doelgenen.
Vergaren van bewijs suggereert dat de driedimensionale organisatie van het genoom een belangrijke functionele rol in een bereik van nucleaire processen speelt, waaronder gene activering1,2,3, repressie4 ,5,,6,,7,8, recombinatie9,10, DNA reparatie11, DNA replicatie12,13, en cellulaire senescentie14. De versterkers van de verre zijn te vinden in de ruimtelijke nabijheid aan de initiatiefnemers dat zij regelen15,16,17, die is essentieel voor goede spatio-temporele gen expressie controle. Versterker verwijderingen Toon dat de versterkers van de distale essentieel voor doel gene transcriptie18,19,20,21,22, en ‘gedwongen chromatine looping zijn’ toont aan dat gemanipuleerde tethering tussen een versterker en haar doel promotor in de Hbb locus is voldoende om te rijden transcriptionele activering23. Verder, genoom herschikkingen die genen te onder de controle van ectopische versterkers brengen kunnen leiden tot ongepaste gene activering en ziekte24,25,26. Samen, illustreren deze voorbeelden dat de promotor-enhancer interacties essentieel voor gene controle zijn en strakke regelgeving om passende genexpressie vereisen. De mens en muis genomen zijn elk geschat op haven rond één miljoen versterkers. Voor de overgrote meerderheid van deze versterkers, doelgenen zijn onbekend, en de “rules of engagement” tussen initiatiefnemers en versterkers zijn slecht begrepen. De versterkers van de transcriptionele toewijzen aan hun doelgenen blijft dus een grote uitdaging in het ontcijferen van bij zoogdiercellen expressie controle.
Ons begrip van drie-dimensionale genoom het platform heeft een revolutie teweeggebracht door de invoering van 3C27 (chromosoom conformatie vangen) en haar varianten28,29,30,31 . De meest machtige van deze technieken, Hi-C (hoge doorvoer chromosoom conformatie vangen) is ontworpen om te identificeren van het hele ensemble van chromosomale interacties binnen een celpopulatie. Hi-C bibliotheken, meestal gegenereerd op basis van miljoenen cellen, zijn zeer complex met een geschatte 1011 onafhankelijke afbinding producten tussen ~ 4 kb fragmenten in het menselijk genoom32. Als een gevolg, betrouwbare en reproduceerbare identificatie van interacties tussen individuele beperking (zoals die met een promotor of versterker fragmenten) van is Hi-C gegevens niet haalbaar, tenzij Hi-C bibliotheken zijn onderworpen aan de ultra-diep sequencing, die is niet een economisch levensvatbare oplossing voor laboratoria routinematig voorbereiding van Hi-C bibliotheken. Om te omzeilen deze tekortkoming, ontwikkelden we promotor vangen Hi-C om specifiek verrijken promotor-bevattende afbinding producten van Hi-C bibliotheken. We gericht op de initiatiefnemers om twee redenen. Eerst, promotor-enhancer contacten is gebleken dat cruciaal is voor goede gen expressie niveaus in tal van studies (Zie de verwijzingen hierboven), en anderzijds als initiatiefnemers grotendeels invariant tussen celtypes zijn, hetzelfde vangen aas systeem kan worden gebruikt om te ondervragen de regelgevende circuits op meerdere celtypen en voorwaarden. Onze aanpak is gebaseerd op-oplossing kruising van Hi-C bibliotheken met tienduizenden biotinyleerd RNA 120mers complementair aan promotor-bevattende Hi-C afbinding producten en latere vangen op daar beklede magnetische kralen. Dit resulteert in PCHi-C bibliotheken met verminderd veel complexiteit in vergelijking met de originele Hi-C-bibliotheek, alleen op de identificatie van fragmenten die aan initiatiefnemers bij aanzienlijk hoge frequenties als ligatuur zijn verbonden.
We hebben gebruikt PCHi-C in een aantal menselijke en muis celtypes om bij te dragen tot een beter begrip van gen expressie controle door blootleggen lange-afstands distale promotor interagerende regio’s met vermeende regulerende functie, evenals niet-random promotor-promotor contacten in de driedimensionale ruimte van de kern. De studies van honderdduizenden promotor-enhancer contactpersonen hebt toegewezen over talrijke cel typen33,34,35,,36,,37,38, 39, ruimtelijke genoom Polycomb repressieve complexe-gemedieerde organisatie van muis embryonale stamcellen7geïdentificeerd, aangetoond grootschalige herbedradingsproces van promotor interactomes tijdens celdifferentiatie37, 38 , 39en gekoppelde niet-coderende ziekte-geassocieerde volgnummer varianten aan gene initiatiefnemers35.
PCHi-C is een ideaal methode om de kaart van het genoom-brede ensemble van DNA-sequenties interactie met initiatiefnemers. De methode van keuze te verkrijgen met een hoge resolutie interactie profielen voor geselecteerde regio genomic’s zijn verwante benaderingen, zoals Capture Hi-C van continue genomic regio’s (Zie discussie). PCHi- en Hi-C vangen zijn zeer vergelijkbaar vanuit een experimentele oogpunt (het enige verschil is de keuze van de opname systeem), zodat de adviezen en richtsnoeren die wij leveren zijn van toepassing op beide benaderingen. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van PCHi-C. Wij schetsen de grondgedachte en het ontwerp van een PCHi-C-experiment, bieden een stapsgewijze PCHi-C bibliotheek generatie protocol en illustreren hoe de kwaliteit van de PCHi-C-bibliotheken op verschillende stappen in het protocol bij het opleveren van hoogwaardige gegevens kan worden gecontroleerd.
Modulair ontwerp voor promotor vangen Hi-C
Promotor vangen Hi-C is ontworpen om specifiek verrijken Hi-C bibliotheken voor interacties voor initiatiefnemers. Deze interacties vormen slechts een subset van afbinding producten aanwezig in de bibliotheek van een Hi-C.
Capture Hi-C kan eenvoudig worden aangepast om te verrijken van Hi-C bibliotheken voor genomic regio of regio’s van belang door het veranderen van het systeem vastleggen. Capture regio’s kunnen continu genomic segmenten44,45,46,48, versterkers die zijn omschreven in de PCHi-C (‘Reverse vangen Hi-C’35) of DNase I overgevoelig sites49 . De omvang van de opname-systeem kan worden aangepast afhankelijk van de experimentele reikwijdte. Bijvoorbeeld Dryden et al. target 519 aas fragmenten in drie gene woestijnen borst kanker44is gekoppeld. Het systeem vastleggen door Martin et al. richt zich op zowel continu genomic segmenten (‘Regio Capture’: 211 genomic regio’s in totaal, 2,131 beperkingsfragmenten) en initiatiefnemers (3,857 gene initiatiefnemers)45geselecteerd.
SureSelect-bibliotheken zijn beschikbaar in verschillende grootte varieert: 1 kb tot 499 kb (5.190 – 4,806), 500 kb tot 2,9 Mb (5.190 – 4,816), en 3 Mb tot 5,9 Mb (5.190 – 4,831). Zoals elke afzonderlijke opname Biotine-RNA 120 nucleotiden lang is, deze vangen systemen geschikt voor maximaal 4,158, 24,166 en 49,166 individuele vangen sondes, respectievelijk. Dit komt overeen met 2,079, 12,083 en 24,583 gerichte beperkingsfragmenten, respectievelijk (merk op dat de aantallen voor beperkingsfragmenten ondergrenzen gebaseerd op de veronderstelling dat de twee afzonderlijke opname sondes kunnen worden ontworpen voor iedere restrictie fragment — in werkelijkheid als gevolg van repetitieve sequenties zal dit niet gebeuren voor iedere restrictie fragment (Zie ook figuur 1B, C), wat resulteert in een hoger aantal targetable beperkingsfragmenten voor een constant aantal beschikbare vangst sondes ).
Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het gebruik van een restrictie-enzym met een 6 bp erkenning site om te ontdekken van lange-afstands interacties. Met behulp van een restrictie-enzym met een 4 bp erkenning site voor grotere resolutie van meer proximale interacties is ook mogelijk40,49.
Beperkingen van PCHi-C
Een inherente beperking van alle chromosoom conformatie vangen tests is dat hun resolutie wordt bepaald door de restrictie-enzym gebruikt voor de generatie van de bibliotheek. Interacties die tussen DNA-elementen gelegen op de dezelfde beperking fragment plaatsvinden zijn onzichtbaar voor ‘C-type’ testen. Verder, in PCHi-C, in sommige gevallen meer dan één transcriptie start website kan zich bevinden op de dezelfde promotor-bevattende beperking fragment en PIRs in sommige gevallen haven zowel actieve en repressieve Histon merken, waardoor het moeilijk te lokaliseren die regelgevende elementen bemiddelen de interacties, en om te voorspellen de regelgevende output van interacties van de promotor. Met behulp van restrictie-enzymen met 4 bp erkenning sites vermindert dit probleem maar gaat ten koste van enorm toegenomen Hi-C bibliotheek complexiteit (Hi-C bibliotheken die zijn gegenereerd met 4 bp erkenning site restrictie-enzymen zijn ten minste 100 keer complexer dan Hi-C bibliotheken die zijn gegenereerd met 6 bp erkenning site restrictie-enzymen), en de bijkomende kosten voor het volgende generatie rangschikken.
Een andere beperking is dat het huidige PCHi-C-protocol vereist dat miljoenen cellen als grondstof, uitschakeling van de analyse van de promotor interacties in zeldzame celtypes. Een gemodificeerde versie van PCHi-C om de ondervraging van promotor contacten in cel populaties met 10.000 tot 100.000 cellen (bijvoorbeeld cellen tijdens de vroege embryonale ontwikkeling of hematopoietische stamcellen) zou dus een waardevolle toevoeging aan het vangen Hi-C de werkset.
Ten slotte, zoals alle methoden die afhankelijk zijn van formaldehyde fixatie, PCHi-C registreert alleen interacties die ‘bevroren worden’ op het tijdstip van fixatie. Dus, om te studeren de kinetiek en de dynamiek van de promotor interacties, methoden zoals Super resolutie levende cel microscopie nodig zijn naast PCHi-C.
Methoden om te ontleden ruimtelijke chromosoom organisatie met hoge resolutie
De enorme complexiteit van chromosomale interactie bibliotheken verbiedt een betrouwbare identificatie van producten van de interactie tussen twee specifieke beperkingsfragmenten met statistische significantie. Om dit probleem te omzeilen, is volgorde vastleggen gebruikt of Hi-C33,34,40,44 of 3 C50,51 bibliotheken voor specifieke interacties te verrijken. Het grote voordeel van het gebruik van Hi-C bibliotheken meer dan 3C bibliotheken voor de verrijking stap is dat de Hi-C, in tegenstelling tot de 3C, een verrijking stap voor echte afbinding producten bevat. Als gevolg daarvan, is het percentage van geldige luidt in PCHi-C bibliotheken ongeveer 10-fold hoger dan in Capture-C bibliotheken50, die ongeveer 5-8% geldig na HiCUP filteren leest. Sahlen et al. hebben rechtstreeks Capture-C tot HiCap, die net als PCHi-C Hi-C bibliotheken gebruikt voor verrijking van de opname, in tegenstelling tot de Capture-C die gebruik maakt van 3 C bibliotheken vergeleken. In overeenstemming met onze bevindingen, vonden ze dat Capture-C bibliotheken zijn voornamelijk samengesteld uit un-ligaturen fragmenten40. Bovendien had HiCap bibliotheken een hogere complexiteit dan Capture-C bibliotheken40.
Een variant op Capture-C, genaamd volgende-generatie Capture-C52 NG Capture-C maakt gebruik van een oligo per beperking fragment einde, als eerder gevestigd in PCHi-C33,34, in plaats van overlappende sondes gebruikt in de oorspronkelijke In Capture-C protocol50. Dit verhoogt het percentage van geldige luidt in vergelijking met Capture-C bescheiden, maar NG Capture-C maakt gebruik van twee opeenvolgende rondes van capture verrijking, en een relatief hoog aantal PCR cycli (20 tot en met 24 cycli in totaal, vergeleken met 11 cycli meestal voor PCHi-C), die leidt onvermijdelijk tot hogere aantallen reeks duplicaten en lagere complexiteit van de bibliotheek. In proef experimenten tijdens de optimalisatie van PCHi-C, vonden we dat het percentage van de unieke (dat wil zeggen, niet gedupliceerd) paren was slechts ongeveer 15 leest % toen gebruikten we 19 cycli van PCR (13 cycli vooraf vastleggen + 6 cycli post vangen; gegevens niet worden weergegeven), maar optimalisatie voor een lager aantal cycli van PCR, levert meestal 75-90% unieke Lees paren. Dus, het verminderen van het aantal cycli van PCR aanzienlijk verhoogt de hoeveelheid informatieve sequencedata.
Een recente methode combineert ChIP met Hi-C te richten op chromosomale interacties gemedieerd door een specifieke proteïne van belang (HiChIP53). In vergelijking met ChIA-PET54, die is gebaseerd op een soortgelijke reden, bevat HiChIP gegevens een hoger aantal informatieve volgorde leest, zodat voor hogere-vertrouwen interactie aanroepen van53. Het zal zeer interessant zijn om te vergelijken direct de bijbehorende HiChIP en vangen Hi-C datasets zodra ze beschikbaar komen (bijvoorbeeld met behulp van een antilichaam tegen de cohesin eenheid Smc1a HiChIP53 met Capture Hi-C voor alle Smc1a gebonden beperking fragmenten) naast elkaar. Een inherente verschil tussen deze twee benaderingen is dat vangen Hi-C niet afhankelijk is van de chromatine immunoprecipitation, en daarom kunnen ondervragen chromosomale interacties ongeacht eiwit bezetting. Hierdoor vergelijking van 3D genoom organisatie in de aan- of afwezigheid van specifieke factor bindende, als is gebruikt voor het identificeren van PRC1 als een zeer belangrijke regelgever van muis ESC ruimtelijke genoom het platform7.
PCHi-C en GWAS
Genoom-brede vereniging studies (GWAS) is gebleken dat meer dan 95% van ziekte-geassocieerde varianten van de reeks in niet-codeert gebieden van het genoom, vaak op grote afstanden naar eiwit-codeert genen55bevinden. GWAS varianten zijn vaak gevonden in nabijheid van DNase ik overgevoelig sites, dat is een kenmerk van sequenties met potentiële regelgeving. PCHi-C en vangen Hi-C hebben is gebruikt uitgebreid initiatiefnemers koppelen aan GWAS risico loci betrokken bij borst kanker44, colorectal kanker48en auto-immune ziekte35,45,46. Een PCHi-C studie over 17 verschillende menselijke hematopoietische cel typen gevonden SNPs geassocieerd met auto-immune ziekte werden verrijkt in de PIRs in lymfoïde cellen, overwegende dat varianten van de reeks die is gekoppeld aan de bloedplaatjes en rode bloedcellen specifieke kenmerken werden voornamelijk gevonden in de macrofagen en erytroblasten, respectievelijk35,56. Dus, specifieke promotor weefseltype interactomes aan het licht gebracht door PCHi-C kan helpen om de functie van niet-coderende ziekte-geassocieerde begrijpen volgnummer varianten en identificeren van nieuwe potentiële ziekte genen voor therapeutische interventie.
Kenmerken van regio’s promotor-interactie
Meerdere lijnen van bewijsmateriaal link promotor interactomes naar gen expressie controle. Ten eerste, verschillende PCHi-C studies hebben aangetoond dat genomische regio’s interactie met initiatiefnemers van (zeer) uitgedrukte genen zijn verrijkt met merken die zijn gekoppeld aan enhancer activiteit, zoals het H3K27 acetylation en p300 bindende33,34 , 37. Wij vonden een positieve correlatie tussen gen expressie niveau en het aantal interacterende enhancers, suggereren dat additieve effecten van versterkers resulteren in verhoogde genexpressie niveaus34,35. Ten tweede, natuurlijke expressie kwantitatieve trait loci (eQTLs) zijn verrijkt met PIRs die zijn aangesloten op de dezelfde genen waarvan de expressie wordt beïnvloed door de eQTLs35. Ten derde, door reis57 en PCHi-C gegevens te integreren, Cairns et al. vond dat reis reporter genen toewijzen aan PIRs in muis SER’s sterker verslaggever genexpressie dan reporter genen op integratie sites in niet-promotor-interactie regio’s weergeven 58, die aangeeft dat de PIRs transcriptionele regelgevende activiteit bezitten. Deze bevindingen stellen samen voor promotor interactomes ontdekt door PCHi-C in verschillende muis en soorten menselijke cellen bevatten belangrijke regelgevende modules voor gen expressie controle.
Het is vermeldenswaard dat versterkers vertegenwoordigen slechts een klein deel (~ 20%) van alle PIRs ontdekt door PCHi-C33,34. Andere PIRs kon hebben structurele of topologische rollen in plaats van directe transcriptionele regelgevende taken. Echter, er is ook bewijs dat PCHi-C DNA-elementen met regelgevende functie die niet klassieke enhancer merken haven doen kan ontdekken. In een menselijke lymfoïde cellijn, werd de promotor van de BRD7 gevonden om te communiceren met een regio verstoken enhancer merken dat bleek te bezitten enhancer activiteit in reporter gene assays33. Regelgevende elementen met vergelijkbare kenmerken kunnen meer overvloedig dan op dit moment gewaardeerd worden. Bijvoorbeeld markeert een CRISPR gebaseerde scherm voor regelgevende DNA elementen geïdentificeerde ongemarkeerd regelgevende elementen (maatregelen) die controle van genexpressie maar zijn verstoken van enhancer59.
In andere gevallen PIRs gebleken haven chromatine merken transcriptionele repressie is gekoppeld. PIRs en interactie initiatiefnemers gebonden door PRC1 in muis SER’s waren betrokken bij een uitgebreid ruimtelijke netwerk van onderdrukte genen, rekening houdend met dat de repressieve mark H3K27me37. In menselijke lymphoblastoid cellen, een verre element interactie met de projectontwikkelaar BCL6 onderdrukt transgenic verslaggever gen expressie33, suggereren dat het functioneren kan om te onderdrukken BCL6 transcriptie in zijn oorspronkelijke context.
PIRs verrijkt voor de bezetting van de chromatine isolator proteïne CTCF in menselijke SER’s en NEC37 kan nog een andere klasse van PIRs vertegenwoordigen. Collectief, suggereren deze resultaten dat PIRs haven een collectie van regelgevende activiteiten in gen nog moet functioneel worden gekenmerkt.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Valeriya Malysheva voor kritische lezing van het manuscript en deskundige hulp met cijfer 1. Dit werk werd gesteund door de Medical Research Council, UK (heer/L007150/1) en de UK biotechnologie en biologische Sciences Research Council, UK (BB/J004480/1).
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
Low-retention filter tips | Starlab | S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830 | |
10x PBS pH 7.4 | Life Technologies | 70011-036 | |
Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
1 M Tris-HCl pH 8.0 | Life Technologies | 15568-025 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
5 M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2) | New England Biolabs | B7002 | |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | |
DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
20% (wt/vol) SDS | Bio-Rad Laboratories | 161-0418 | |
20% (vol/vol) Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
HindIII, 100 U/uL | New England Biolabs | R0104 | |
10 mM dCTP | Life Technologies | 18253-013 | |
10 mM dGTP | Life Technologies | 18254-011 | |
10 mM dTTP | Life Technologies | 18255-018 | |
0.4 mM Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524-016 | |
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210 | |
10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202 | |
100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001 | |
T4 DNA ligase, 1 U/μL | Invitrogen | 15224-025 | |
RNase A | Roche | 10109142001 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
20 000×g 50 ml centrifuge tube | VWR | 525-0156 | |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
Phenol pH 8.0 | Sigma | P4557 | |
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Sigma | P3803 | |
Sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | |
Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1) | New England Biolabs | B7202 | |
NheI, 100U/uL | New England Biolabs | R0131 | |
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials | Covaris | 520045 | For sonication |
SPRI beads (Agencourt AMPure XP) | Beckman Coulter | A63881 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65001 | |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
10 mM dATP | Life Technologies | 18252-015 | |
T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203 | |
T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow exo minus 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212 | |
Quick ligation reaction buffer | New England Biolabs | B6058 | |
NEB DNA Quick ligase | New England Biolabs | M2200 | |
PE adapter 1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3') |
Illumina | ||
PE adapter 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3') |
Illumina | ||
NEB Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530 | |
PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3') |
Illumina | ||
PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3') |
Illumina | ||
PCR strips | Agilent Technologies | 410022 and 401425 | |
SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit | Agilent Technologies | 931108 | |
SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | custom design mouse or human PCHi-C system |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65601 | |
E220 high-performance focused ultra-sonicator | Corvaris | E220 |