肺葉切除: 形態学的肝再生手術モデル
Summary
新生児 (0 日) マウス肝左葉部分切除の新しい方法を紹介します。この新しいプロトコルは、急性肝障害や新生児の設定で傷害応答勉強に適しています。
Abstract
形態学的器官再生急性組織の損失は下等脊椎動物の間で共通ですはめったに生後哺乳類で観察。70% 肝部分切除後の成人の肝再生の残り葉の代謝活性の回復が負傷した葉の形態と建築の永久的損失のいくつかのレプリケーションによって肝細胞肥大の結果します。ここでは、生理学的環境の再生に資する葉新生児の新しい手術法を詳しく説明します。このモデルは、左葉の頂点と後続の保守的な管理療法の切断を含む、主要な血管と肝臓の化学損傷、再生が発生する生理学的環境を残して結紮術の必要性を欠いています。我々 は、切断中に負傷した肝臓は肥大による臓器再生から代償成長する遷移の少年 (P7-14) マウスでこのプロトコルを拡張します。提示された、簡単な 30 分プロトコルは、再生、哺乳類で、加齢に伴う減少と推定される肝幹・前駆細胞評価のメカニズムを研究するためのフレームワークを提供します。
Introduction
臓器を再生するまたはの形と機能を復元する能力は、進化の過程で失われる主と考えられています。肥大の波および機能が、その結果、細胞分裂のいくつかのラウンドに終ってすべての残存肝細胞の動員を含む化学または物理的な外傷の急性期後大人の哺乳類の肝臓の再生の可能性が見つかってください。アーキテクチャの異なる器官1,2,3,4,5。最近、研究は生命6,7,8の最初の週内の傷害に新生児の哺乳類の器官の再生応答特性を始めています。これらの研究では、新生児の開発中に負傷したとき特定の哺乳類の臓器が代わりに代償的な成長または線維症7,8形態再生対応を示しています。
最近の研究では、グローバルな構造と機能の両方の再生が早期新生児期6,7,8中に発生することを示しています。確立された肝障害プロトコルを含む化学傷害またはエタノール9,10,11, アセトアミノフェン12,13,14,15 の管理、四塩化炭素16,17,18,1970% 肝部分切除4,20,21, または左の除去と中央の葉。化学管理肝細胞死につながるが、しばしばミクロ構造とマクロ構造はそのまま残ります。形態学上の再生は、肝全体のアーキテクチャが消失しないよう容易にこのコンテキストで勉強できません。70% 肝部分切除は出血を止めるために必要な主要な血管の縫合結紮を伴いますが、血管の永久的な停止、非生理的な環境を残します。さらに、このメソッドは、大人の齧歯動物にのみ使用されています、新生児への応用が技術的に非常に困難であります。これを念頭において、新生児の P0 マウスで左葉の頂点の 20-30% を除去する手法を開発した (図 1 a-1 b)。このメソッドは、手術に保守的な低侵襲、技術的に挑戦し、総発生する再生のための部屋を去る血管の結紮せず形態の損失に 。以下に示す結果のステップバイ ステップ プロトコルできます出生後の人生の初期段階で新生児再生は哺乳類を研究するために新生児マウスに肺葉切除を行う研究者。このメソッドの人生の後の段階の間に、肝臓で使用されることができます再生医療と幹細胞生物学、比較研究に明確なアプリケーションも備わっています。
最も一般的な急性肝障害の研究は、化学的に誘発された損害、成人の肝臓切断または 70% 肝部分切除です。化学的損傷はしばしばアセトアミノフェン、四塩化炭素、またはエタノール、静脈内投与、腹腔内や口腔管理を含み、比較的簡単かつ非侵襲的損傷モデルです。前述したように、肝細胞の細胞死が多くの場合葉質と柔組織構造形態再生についての主張をするが難しく、そのまま化学的損傷の結果。化学的損傷しばしば肝血管を中心にサイトや特定の細胞傷害を研究する有用な手法となって、また困難、血管から遠いことに位置しています可能性があり、可能性があります他の集団全体の臓器レベルで調査するには再生に貢献します。これらの制限にもかかわらず化学的損傷では、有用で関連性高い生理学的損傷モデルがまだ残っています。
大人 70% 肝部分切除は、肝血管の結紮左と中央の葉の除去を含みます。肝切除への応答はよく特徴付けられる: 切断された肝臓 14 日ポスト 70% 肝部分切除は、残り右と尾状葉の肝細胞として元の無傷の葉の著しく異なるアーキテクチャを開発肥大と細胞分裂4、5のいくつかのラウンドを受けます。これは、質量の喪失や機能、構成しますが、2 つの切断された葉を再生成する失敗し、したがって総形態を置き換えません。その結果、70% 肝部分切除への傷害応答は限られた再生と代償成長機構の研究に有用です。
ここでは、我々 は完全に新生児の肺葉切除のためのプロトコルをについて説明します。手順には、適切な動物の選択と準備、手術フィールドの準備、手術と回復が含まれます。最適化、これらの各手順の適応プロトコルのさまざまなアプリケーションの必要があります。
ただし、異なる細胞集団と再生のメカニズムを研究する我々 も使用様々 な Cre をかくまっているマウスを含む様々 なトランスジェニック動物、広く実行して野生型 c57bl/6 j 子犬 (JAX 000664) 上でこのプロトコルを最適化し、CreERT2 遺伝子および/またはノック アドイン (018867, Axin2CreERT2 JAX とSox9CreERT2 JAX 018829) 虹と mTmG システム (R26VT2/GK3などの蛍光レポーターとの組み合わせでR26mT/mG)22,23します。 異なるマウス系統のこの方法を変更する必要が見つかりません、存続の結果または再生の可能性に差は認められなかった。
系統の異なる動物の使用、に加えてまた 4-ヒドロキシ タモキシフェンや 5-エチニル-2 ‘-デオキシウリジン (EdU) などの小分子を投与した新生児マウスに部分的な小葉肝切除を実行しました。ジメチルスルホキシド (DMSO) とエタノールは、そのコーン油は罹患率の重要な原因が分かった、溶剤として使用されました。それ以外の場合、小分子の腹腔内投与は生存率や再生結果を与えないことがわかった。このプロトコルが再生のさまざまな側面を調査する他の小さな分子用適応されると見込んでいます。
新生児マウス手術は技術的に困難なことができ、動物取り扱いと顕微解剖に特別な専門知識を必要があります。畜産専門知識が母体の共食いを避けるために必要手術後、即時回復期間中に。
Protocol
Representative Results
Discussion
急性肝障害は、化学 (アセトアミノフェン、エタノール、四塩化炭素)、または外科的モデル (70% 肝部分切除) を使用して伝統的に研究されています。70% 肝部分切除後再生応答は、グローバル肝細胞肥大や複数回の細胞分裂4,5の特徴づけられています。出血を止め、しかし、このモデルに制限が再生のための異常な環境を残した主要な血管を結紮す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は H & E と組織; 実行するため P. 朱に感謝します。C. 王と役に立つ議論のため A. マッカーティ。研究は、がん研究のためのバージニアと d. k. ルートヴィヒ基金から資金をサポートされていました国立心臓、肺、血液研究所 (R01HL058770 および U01HL099999)。フジテ Y.R. 再生医療 (RC1 00354) 助成金のためのカリフォルニア協会に支えられた人間フロンティア科学プログラム キャリア開発賞 (CDA00017)、ドイツ研究振興協会 (RI 2787/1)、Siebel の幹細胞研究所と、トーマスとステイシー Siebel 財団 (1119368-104-GHBJI)。J.M.T. は、新しいアメリカの NIH (T32GM007365)、国立研究サービス賞 (1F30DK108561) とポールとデイジー ソロス交わりによって支えられました。
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
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