Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.
Uma técnica útil para o cultivo de células em um auto-montagem andaime nanofibras tridimensional (3D) é descrita. Este sistema de cultura recria um ambiente que imita pròxima as características estruturais do tecido não-polarizado. Além disso, a estrutura particular de nanofibras intrínseca do cadafalso torna transparente à luz visual, que permite a fácil visualização da amostra sob microscopia. Esta vantagem foi largamente usada para estudar a migração celular, organização, proliferação e diferenciação e, portanto, qualquer desenvolvimento de sua função celular específica pela coloração com corantes específicos ou sondas. Além disso, neste trabalho, descrevemos o bom desempenho deste sistema facilmente estudar o redifferentiation de condrócitos articulares humanos expandidos no tecido cartilaginoso. As células foram encapsuladas em auto montagem de andaimes de peptídeo e cultivadas sob condições específicas para promover a condrogênese. Culturas tridimensionais mostraram boa viabilidade durante as 4 semanas do experimento. Como esperado, amostras cultivadas com indutores de chondrogenic (comparados aos controles não-induzida) manchado fortemente positivas para o azul de toluidina (que manchas de glicosaminoglicanos (GAGs) altamente presentes na matriz extracelular da cartilagem) e expressa marcadores moleculares específicos, incluindo o colágeno tipo I, II e X, de acordo com a análise de Western Blot. Este protocolo é fácil de executar e pode ser usado em laboratórios de pesquisa, indústrias e para fins educacionais em cursos de laboratório.
Por muitas décadas, cultura de células de mamíferos foi realizada sob condições experimentais usando sistemas clássica bidimensional (2D) cultura devido a problemas de práticos e econômicos, independentemente dos aspectos não-fisiológica. Embora este sistema de cultura ajuda a estudar e entender mais os mecanismos moleculares e celulares, hoje sabemos que novos paradigmas de cultura de células são necessárias para estudar sistemas celulares mais complexos. Portanto, sistemas tridimensionais (3D) cultura são necessários para recriar um microambiente que é base, biomecanicamente e biologicamente mais semelhante dos tecidos naturais. Nos últimos anos, sistemas de cultura 3D, em geral, tornaram-se mais prevalentes entre pesquisadores e indústria desde que eles representam um novo modelo de estudo ou de triagem em que as células podem crescer no espaço, criar célula a célula ou interacções célula-a-matriz, migrar e eventualmente se diferencie em linhagens de células específicas.
O objetivo geral desta metodologia é recriar um em vitro microambiente celular que está mais perto do microambiente no vivo . Em particular, o andaime de peptídeo de auto-montagem sintético (SAPS) é um tipo de biomaterial com propriedades únicas; forma uma rede de poros nanômetros de tamanho feito de interações fracas entre peptídeos com propriedades mecânicas e estruturais semelhantes as de matrizes extracelulares naturais. Em outras palavras, a racionalidade por trás o uso deste material é que ele cria um verdadeiramente 3D-ambiente que é ideal para a obtenção de tecidos de pseudo-3D ou unidades do órgão. No entanto, mais importante ainda, o contexto 3D permite que a estrutura 3D ganhar novas funções biológicas que normalmente não estão presentes em plataformas 2D de cultura, tais como propriedades relacionadas à arquitetura do tecido, fenômenos de transferência de massa, a padronização de células e, eventualmente, morfogênese de tecido, que são fatores-chave em futuras pesquisas e desenvolvimento de tecidos funcionais e órgãos1,2. Além disso, uma vantagem de sucos sobre os seus homólogos naturais (colágeno, Matrigel) é que eles são muito estáveis à temperatura ambiente e não necessitam de condições especiais para a pós-produção, distribuição ou armazenamento3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sucos é fácil de manusear, quando desejado; Géis 3D podem ser obtidos simplesmente pelo aumento da força iônica ou ajustando o pH a neutralidade1,2. Finalmente, a metodologia descrita aqui tem sido extensivamente usado em vitro para promover a manutenção, crescimento e diferenciação de vários tipos de células, incluindo condrócitos, hepatócitos, células endoteliais, osteoblastos, células neuronais também como as células-tronco embrionárias e somática3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. no presente trabalho, descrevemos a utilização de um sistema 3D-cultura para diferenciar condrócitos articulares expandidos humanos (HAC) em tecido de cartilagem-como, como descrito anteriormente,11.
Aqui, um método para células de cultura em um sistema 3D usando sucos é descrito. Neste biomaterial sintético, células primeiro são misturadas com uma solução de peptídeo, que posteriormente é induzida a auto-montagem, criando uma rede de dimensões nanométricas ao redor das células e, portanto, criar um ambiente verdadeiramente 3D (Figura 1). É importante considerar que o comportamento celular é afetado pelos valores de rigidez de matriz (ou seja, proliferação, migração e diferenciação). Portanto, um controle metodológico comum é células de cultura em cima do andaime de peptídeo com os mesmos valores de rigidez (cultura em duas dimensões).
Anteriormente, o nosso grupo e outros descreveram o uso de plataformas tridimensionais (3D) cultura com célula diversos sistemas3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. No presente trabalho, descrevemos um método fácil e confiável de se obter cultura 3D sistemas que são aplicáveis a qualquer tipo de células de mamíferos incluindo qualquer tipo de célula funcional, embrionário ou adulto células-tronco, ou eventualmente, disfuncionais células isolaram de biópsias ou tumores e assim por diante. Além disso, independentemente, se as células estaminais são de origem embrionária ou adulta têm uma melhor capacidade de compromisso linhagem no ambiente 3D do que na cultura 2D clássica pratos10,11,12, 13,14,15. Portanto, a cultura de pilha neste sistema conduziria à diferenciação em estruturas de tecido-como funcionais que podem ser utilizadas em aplicações diferentes, de Biomedicina reparativa ou regenerativa para plataformas toxicológicas e farmacológicas.
Mostramos um claro ganho em função da célula porque o microambiente celular é semelhante dos tecidos naturais em termos de estrutura matricial e parâmetros biomecânicos, biofísicos e biológicos. No entanto, como o sistema se torna mais complexo, o número de parâmetros que precisam ser regulamentados também aumenta, que inclui a necessidade de uma plataforma de apoio externa (por exemplo, um sistema de perfusão ativo para evitar problemas de associada a fenómenos de transferência de massa ). Tridimensionalmente culturas de células de melhor desempenho em termos de regulação de atividades essenciais, tais como a migração, proliferação e diferenciação. Eles podem formar redes complexas, permitindo a interferência celular reforçada, que é, de longe, uma consequência essencial do crescimento e diferenciação em 3D. O facto de sucos poderia criar condições em vitro semelhante a essas proteínas de matriz extracelular representa uma vantagem desde um estudo racional do efeito produzida por cada componente adicionado para o cadafalso (fator de crescimento, polissacarídeo ou sinalização peptídeo) poderia ser facilmente realizado.
As claras vantagens do uso de sucos em comparação com outros andaimes naturais, tais como colágeno tipo I e o Matrigel, são os seguintes: 1) SAPS é um biomaterial sintético com variação mínima do lote de produção de lotes; 2) sucos tem a capacidade de ser acrescida com motivos de peptídeo específico; e 3) presentes sucos de baixa biodegradabilidade em vitro, que permita a manutenção da construção 3D com as mesmas propriedades biofísicas, biomecânicas e estruturais ao longo do tempo. No entanto, a limitação do uso de sucos contra outros andaimes é encontrado durante a etapa de encapsulamento, onde as células estão em um ambiente hostil devido ao baixo pH. Portanto, este é um passo crítico na metodologia descrita. Além disso, é importante definir a concentração de sucos para cada tipo de célula específica antes de iniciar qualquer experimento. Isto é, de facto, essencial quando as células são cultivadas sobre ou para dentro esses biomateriais, desde que cada tipo de célula específica apresentará condições de crescimento biomecânica ideal.
Finalmente, acreditamos que o projeto e a fabricação deste tipo de andaime biomaterial aumentaria o desenvolvimento de modelos de tecido 3D mais fisiológica e de confiança para ajudar a indústria farmacêutica para desenvolver melhor as abordagens terapêuticas para medicina regenerativa, câncer ou qualquer tratamento médico.
The authors have nothing to disclose.
A pesquisa realizada pelos autores foi apoiada em parte por subsídios da União Europeia sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) sob Grant acordo n. º 229239 e da Fundação AO, exploratória pesquisa colaborativa pesquisa programa aguda Cartilagem ferimento/lesão/defeito (CRP ACI) no âmbito do projecto Bioactive e andaimes biomimético para regeneração de cartilagem (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |