Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.
DNA 복제 타이밍은 중요 한 세포 특성, 전시 chromatin 구조, 전사, 및 DNA 돌연변이 속도와 중요 한 관계 이다. 복제 타이밍에 변화가 개발 과정 및 암, 하지만 역할 복제 타이밍 개발에서 활약 하 고 질병 알려져 있지 않다. Zebrafish 최근 연구 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 설립 되었다. 여기 상세한 DNA 복제 타이밍을 결정 하는 제 브라를 사용 하기 위한 프로토콜. 성인 zebrafish 태아에서 셀 정렬 후 다음 세대 시퀀싱 데이터의 분석을 통해 DNA 복사본 수에 변화를 확인 하 여 고해상도 게놈 전체 DNA 복제 타이밍 패턴을 생성할 수 있습니다. Zebrafish 모델 시스템은 개별 세포 유형, 질병 모델, 또는 돌연변이 라인에 변화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 개발, 걸쳐 vivo에서 발생 하는 복제 타이밍 변경의 평가 대 한 수 있습니다. 이러한 방법을 개발 하는 동안 메커니즘 및 복제 타이밍 설립 및 유지 보수의 결정 요인 조사 연구 하면, 역할 복제 타이밍 돌연변이 tumorigenesis, 및 perturbing의 효과 개발 및 질병에 복제 타이밍입니다.
셀 분할 성공적으로, 그들은 먼저 정확 하 고 충실 하 게 복제 해야 그들의 전체 게놈입니다. 게놈 복제 재현할 패턴, DNA 복제 타이밍 프로그램1에서 발생 합니다. DNA 복제 타이밍 chromatin 조직, 후 성적인 부호 및 유전자 식2,3와 상관 된다. 복제 타이밍에 변화 개발, 걸쳐 발생 되며 크게 transcriptional 관련된 프로그램 및 변경 chromatin 마크와 조직4,5. 또한, 복제 타이밍 mutational 주파수와 상관 및 타이밍에서 변경 다양 한 유형의 암6,7,8에서 관찰 된다. 이러한 관측에도 불구 하 고 메커니즘 및 복제 타이밍 설립 및 규정의 결정 요인 여전히 크게 알려지지 않은, 하 고 개발에서 재생 역할 질병 결정 됩니다. 또한, 최근 게놈 넓은 복제까지 타이밍 척추 개발에 걸쳐 발생 하는 변화 했다만 되어 검사 셀 문화 모델에.
Zebrafish, Danio rerio는 개발 하는 동안 복제 타이밍에서 vivo에서 공부 하는 데 적합 한 짝짓기 쌍 포유류 개발9, 많은 유사점을 빠르게 개발 하는 배아의 수백의 얻을 수 있습니다. 10. 또한, zebrafish 개발에 걸쳐 세포 주기, chromatin 조직과 DNA 복제 타이밍11관계를 공유 하는 transcriptional 프로그램에 변화가 있다. Zebrafish는 또한 우수한 유전자 모델 그들은 특히 순종 transgenesis, mutagenesis, 그리고 타겟된 돌연변이, 조작 하 고 유전 스크린 척 추가 있는 발전12에 필요한 많은 유전자를 확인 했다. 따라서, zebrafish 복제 타이밍 설립 및 유지 보수에 관련 된 유전자를 식별 하 고 deregulating 척추 개발에 복제 타이밍의 효과 관찰을 사용할 수 있습니다. 유전자 변형 라인 복제 타이밍 개별 셀 형식 다른 발달 timepoints 또는 질병 조건에서 고립에서 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 인간 질병 질병 형성 및 진행9,,1314복제 타이밍의 역할을 조사 하는 데 사용할 수의 다양 한 zebrafish 모델 있다.
최근, 첫 번째 복제 타이밍 프로필 zebrafish, 복제 vivo에서15시간을 공부 하는 모델 시스템으로 수립에서 생성 되었습니다. 이 위해 세포는 성인 제 브라에서 고립 된 셀 형식 및 개발의 여러 단계에서 zebrafish 태아에서 수집 되었다. 셀은 다음 FACS (형광 활성화 된 세포 분류) DNA 내용에 따라 g 1과 S 단계 인구를 분리 하 여 정렬 됩니다. G 1 샘플을 사용 하 여 복사 번호 컨트롤로 복사 번호 유사 S 단계 인구에서 결정 되었고 상대 복제 타이밍16를 유추 하는 데 사용. 복제 타이밍에 있는 변화 다음 비교 될 수 있다 직접 다른 발달 샘플 및 세포 유형 사이 고이 비보에 척추 개발에 걸쳐 발생 하는 복제 타이밍에 변화를 결정 하는 데 사용 되었다. 이 방법은 제공 합니다 다른 게놈 방법에 비해 몇 가지 장점을 주로 티 미 딘 아날로그 또는 DNA4,6의 immunoprecipitation로 필요 하지 않습니다 그.
여기 상세한 프로필 게놈 전체 DNA 복제에서 타이밍에 프로토콜 zebrafish에 고해상도. 이러한 프로토콜 zebrafish 게놈으로 개발 하는 동안 발생 하는 이러한 관계에 변화를 프로 파일링에서 게놈 그리고 후 성적인 기능 관계를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 프로토콜은 또한 쉽게 복제 타이밍 zebrafish의 돌연변이 체 긴장 및 질병 모델에에서 변화를 공부에 적응 됩니다. 또한이 메서드는 첫 번째는 제 브라에서 개별 셀 유형을 밖으로 정렬 하 여 특정 세포 유형에서 복제 타이밍을 연구에 따라 확장 될 수 있는 토대를 제공 합니다. Zebrafish는 우수한 vivo에서 모델 시스템으로 복제 타이밍을 공부 하 고 궁극적으로 중요 한이 후 성적인 특성의 생물 학적 기능을 사용할 수 있습니다.
Zebrafish는 새롭고 독특한 vivo에서 모델 시스템 공부 DNA 복제 타이밍을 제공 합니다. 타임된 matings로 수행 되는 때이 실험 프로토콜에 자세히, 배아의 수천을 수집할 수 있습니다에 실험에 대 한 하루. 이러한 배아 동기적으로 정확 하 게 초과 하 고 분명히 특징이 개발의 단계를 통해 개발. 제 브라 수 있습니다 쉽고 정확 하 게 준비 zebrafish 태아 외부에서 개발 하 고 광학 투명 한 stereomicroscope?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 일반 의료 과학을 통해 국립 보건원의 5P20GM103636-02 (포함 Flow Cytometry 코어 지원) 및 1R01GM121703, 부여로 오클라호마 센터에서 성인 줄기 세포에 대 한 수상 연구입니다.
NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
EDTA | Sigma | E9844 | |
SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
Proteinase K | NEB | P8107S | |
Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
Glycogen | Ambion | AM9510 | |
RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
Matlab | Mathworks | version 2017a | |
Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |