Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae
Summary
Этот метод описывает клонирования, выражения и очистки рекомбинантных Nsa1 для определения структурных рентгеноструктурного анализа и малым угол рентгеновского рассеяния (лучей) и применим для гибридных структурный анализ других белков содержащие оба заказал и неупорядоченных доменов.
Abstract
Определение структуры полнометражного рибосома Ассамблеи фактора Nsa1 от Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) является сложной задачей из-за неупорядоченных и протеазы лабильной C-конечная белка. Эта рукопись описывает методы для очистки рекомбинантных Nsa1 от S. cerevisiae для структурного анализа рентгеноструктурного анализа и лучей. Рентгеноструктурного анализа был использован для решения структуры упорядоченный WD40 N-концевой домен Nsa1, а затем лучей был использован для устранения структуры C-конечная Nsa1 в растворе. Решение рассеяния данные были собраны из полнометражных Nsa1 в растворе. Теоретические рассеяния амплитуд были рассчитаны с высоким разрешением кристаллической структуре WD40 домена, а затем сочетание твердого тела и ab initio моделирования показала C-конечная Nsa1. Через этот гибридный подход был реконструирован Четвертичная структура всей белка. Представленные здесь методы должны быть общеприменимыми для гибридных структурные определения других белков, состоящий из смеси структурированных и неструктурированных доменов.
Introduction
Рибосомы являются большие рибонуклеопротеида машины, которые осуществляют важную роль перевода мРНК на белки во всех живых клетках. Рибосомы состоят из двух субъединиц, которые производятся в рамках сложного процесса, называют рибосома биогенеза1,2,3,4. Эукариотические рибосомы Ассамблея полагается на помощь сотни основных рибосомных Ассамблеи факторов2,3,5. Nsa1 (Nop7 связанные 1) является фактором Ассамблеи Эукариотические рибосомы, что конкретно требуется для производства большой субъединицы рибосомальной6, и это известный как WD-повторяю, содержащий 74 (WDR74) в высших организмов7. WDR74 было показано, для формирования бластоцисты в мышей8и промоутер WDR74 часто мутирует в раковых клетках9. Однако функция и точных механизмов Nsa1/WDR74 в Ассамблее рибосомы по-прежнему в основном неизвестны. Чтобы начать раскрыть роль Nsa1/WDR74 во время созревания Эукариотические рибосомы, несколько структурные анализы, включая рентгеноструктурного анализа и малоуглового рентгеновского рассеяния (лучей)10.
Рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии, электронной микроскопии и лучей являются все важные методы для изучения макромолекулярной структуры. Размер, форма, доступность и стабильность макромолекул воздействий структурной биологии метод, для которого особенно макромолекулы будет лучше подходит, однако сочетая несколько методов через так называемый «гибридный» подход становится 11все более полезным инструментом. В частности рентгеноструктурного анализа и лучей являются мощными и взаимодополняющие методы структурной определения макромолекул12.
Кристаллография обеспечивает высоким разрешением атомных структур, начиная от маленьких молекул до больших клеточными как рибосомы и привела к многочисленным прорывам в понимании биологических функций белков и других 13макромолекул. Кроме того на основе структуры наркотиков дизайн использует власть кристаллических структур молекулярного стыковки, вычислительные методы, добавление критическое измерение наркотиков открытие и развитие14. Несмотря на его широкую применимость гибкие и неупорядоченных систем сложно оценить, кристаллография, так как кристалл упаковка может быть затруднено или карт плотности электронов может быть неполным или низкого качества. И наоборот лучей является на основе решения и разрешением структурный подход, способный описания гибких систем, начиная от неупорядоченных петель и Термини неразрывно неупорядоченных белки12,,1516. Учитывая, что это совместимо с широкий спектр частиц размерами12, лучей может работать синергически с кристаллографии расширить спектр биологических вопросов, которые могут быть рассмотрены структурные исследования.
Nsa1 подходит для гибридных структурный подход, потому что она содержит структурированный WD40 домена следуют функциональный, но гибкие C-конечная, которая не поддается методы рентгеноструктурного анализа. Ниже — это протокол для клонирования, выражения и очистки Nsa1 S. cerevisiae для гибридных структурные определения рентгеноструктурного анализа и лучей. Этот протокол может быть адаптирована для изучения структур других белков, которые состоят из комбинации упорядоченной и неупорядоченной регионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя этот протокол, рекомбинантных Nsa1 от S. cerevisiae был сгенерирован для структурных исследований рентгеноструктурного анализа и лучей. Nsa1 было хорошо себя вели в растворе и кристаллизуется в нескольких формах кристалл. В процессе оптимизации этих кристаллов было обнаружено, ч…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Дифракция данные были собраны на юго-востоке региональных совместных доступ команды (SER-CAT) 22-ID и 22-BM излучение в Advanced Фотон источник (APS), Аргоннской национальной лаборатории. ЛУЧЕЙ данные были собраны на СИБИЛЛЫ излучение на заранее источника света (ALS), Лоуренса Беркли национальной лаборатории. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников на излучение СИБИЛЛЫ за их помощь с удаленного сбора и обработки информации. Мы признательны исследований спектрометрии массы национального института окружающей среды медицинских наук (NIEHS) и группа поддержки за помощь в определении границ домена протеина. Эта работа получила поддержку от нас Национальный институт здравоохранения интрамуральных исследований программа; США Национальный институт наук санитарного состояния окружающей среды (NIEHS) (Зия ES103247 на р. е. с.) и канадский институты медицинских исследований (КНИИЗ, 146626 до M.C.P). Использование APS было поддержано Министерством энергетики США, управление науки, отделение фундаментальных наук энергии под контракт № W-31-109-Рус-38. Использование передовых источника света (ALS) было поддержано директор, управление науки, управление основные энергии наук, Министерство энергетики США под контракт № ДЕ AC02-05CH11231. Дополнительная поддержка для лучей СИБИЛЛЫ излучение происходит от национального института здравоохранения Минос (R01GM105404) и проекта элитного инструментария Грант S10OD018483. Мы также хотели бы поблагодарить Андреа Луна и доктор Сара Андрес за их критическое прочтение этой рукописи.
Materials
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
References
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
- Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
- Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
- Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
- Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
- Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
- Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
- Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
- Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
- Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
- Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
- Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
- Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
- Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
- Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
- Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
- Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
- Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
- Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
- Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
- . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
- Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
- Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
- Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
- Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
- Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
- Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
- Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
- Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
- Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).
