Samler bevis støtter ideen om at sykdomsfremkallende protein aggregater knyttet til nevrodegenerative sykdommer spre mellom celler med prion-lignende egenskaper. Her beskriver vi en metode som gjør at visualisering av celle-til-celle spredning av prion som aggregater i modellen organismen, Drosophila melanogaster.
Protein samling er en sentral funksjon for de fleste nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Protein aggregater er nært forbundet med neuropathology i disse sykdommer, men den eksakte mekanismen som avvikende protein aggregering forstyrrer vanlig mobilnettet homeostase ikke er kjent. Nye data gir sterk støtte for hypotesen at sykdomsfremkallende mengdefunksjoner i Annonsen, PD, HD, og ALS har mange likheter prioner, som er bare protein smittestoffer ansvarlig for smittsomme kugalskap Anne encephalopathies. Prioner replikere selv av templating konvertering av innfødt-brettet versjoner av samme protein, forårsaker spredning av aggregering fenotypen. Hvordan prioner og prion-lignende proteiner i Annonsen, PD, HD og ALS trekk fra en celle til en annen er et område av intens gransking. Her beskrives Drosophila melanogaster modell som tillater overvåking av prion-lignende, celle-til-celle overføring av mutant huntingtin (Htt) aggregater forbundet med HD. Denne modellen tar nytte av kraftige verktøy for å manipulere transgene uttrykk i mange forskjellige Drosophila vev og benytter en fluorescently merket cytoplasmatiske protein til direkte rapport prion som overføring av mutant Htt aggregater. Viktigere, kan tilnærmingen vi beskriver her brukes til å identifisere romanen gener og veier som megle spredning av protein aggregater mellom ulike cellen typer i vivo. Informasjon fra disse studiene utvide begrenset forståelse av patogene mekanismer som ligger til grunn for nevrodegenerative sykdommer og avsløre nye muligheter for terapeutisk intervensjon.
Prion hypotesen uttaler at smittsomme agent ansvarlig for smittsomme kugalskap Anne encephalopathies (f.eksCreutzfeldt – Jakob sykdom hos mennesker, Skrapesyke sauer, kronisk herjer sykdom i hjort og elg og “kugalskap” i storfe ) utelukkende består av protein og blottet for nukleinsyrer1. Prionsykdommer inneholder mobilnettet prion protein (PrPC) en ikke-native, stabil fold (PrPSc) som er svært beta ark-rik og kan selv reprodusere ved konvertering og rekruttere monomerisk PrPC molekyler i stabil amyloid samler. PrPSc aggregater bruke denne selvreproduserende mekanismen for å spre mellom forskjellige cellene i en organisme og mellom individuelle organismer2.
Protein misfolding og aggregering er også en sentral funksjon for de fleste nevrodegenerative sykdommer (Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS))3. Dannelsen av intra – eller ekstra cellular aggregert protein samlinger i disse sykdommene er nært forbundet med cytotoksisitet4 og fortsetter langs svært reproduserbare og sykdom-spesifikke stier gjennom hjernen over tid5, 6. disse mønstrene spredningen foreslår at sykdomsfremkallende aggregater knyttet disse lidelser har prion-lignende egenskaper. Sterk støtte finnes nå prion som overføring av aggregater forbundet med Annonsen, PD, HD og ALS – de spredte seg fra celle til celle og mal conformational endringen av monomerisk samme protein i tidligere upåvirket celler7, 8.
Fleste studier undersøker prion som spredning av protein aggregater hittil har utført med pattedyr celle kultur modeller, der aggregater overføring i cytoplasma naiv celler fra ekstracellulære plass eller fra en annen celle cytoplasma9,10,11,12,13,14,15, eller injisere samlet inneholder materiale i musen hjerner og overvåking samle utseende utenfor de injeksjon område16,17,18,19,20,21,22, 23. mer nylig transgene dyrene har blitt brukt til å demonstrere at intracellulær aggregater spre seg til andre celler i intakt hjerner24,25,26,27, 28,29,30. Her beskriver vi en metode for direkte visualisering av samlet overføring mellom enkeltceller i Drosophila melanogasterintakt hjerne. Drosophila modeller av HD/polyglutamine (polyQ) sykdommer ble først utviklet nesten to tiår siden31,32 og har gitt mange uvurderlig innsikt i de patogene mekanismene som ligger til grunn for disse lidelser 33. HD er en arvelig nevrodegenerativ lidelse forårsaket av en autosomal dominant mutasjon i genet som koder for protein huntingtin (Htt)34. Denne mutasjonen resulterer i utvidelsen av polyQ strekk nær Htt’s N-terminus utover en sykdomsfremkallende terskel for ~ 37 glutamines, forårsaker protein misfold og samlet35,36. Vill-type Htt proteiner som inneholder < 37 glutamines i denne strekningen oppnå sin opprinnelige fold, men kan induserte å samle på direkte fysisk kontakt med en Htt samlet "frø"12,27,37. Vi utnytte denne homotypic, kjerne samling av vill-type Htt som en avlesning for prion-lignende overføring og cytoplasmatiske oppføring av mutant Htt aggregater opprinnelse i andre celler.
Bestemme mekanismer av hvilke prion som aggregater kan reise mellom celler føre til identifisering av romanen terapeutiske mål for uhelbredelig nevrodegenerative sykdommer. Vi tar nytte av rask levetid, brukervennlighet og genetisk tractability av Drosophila melanogaster definere molekylære mekanismer for celle til celle spredning av mutant Htt aggregater. Vår eksperimentelle strategi benytter to binære uttrykk systemer tilgjengelig i Drosophila, den veletablerte Gal4-spesifikke oppstrøms aktivering sekvens (Gal4-UAS) systemet38 og den nylig utviklet QF-QUAS systemet39. Koble disse to uavhengige systemene kan begrense uttrykk for mutant og vill-type Htt effekter av transgener til ulike celle populasjoner i samme fly40. Bruker denne tilnærmingen, undersøke vi prion som spredning av mutant Htt ved å overvåke videreformidling av cytoplasmatiske vill-type Htt fra tilstanden vanligvis diffus, løselig til en samlet stat, en direkte konsekvens av fysisk kontakt med en pre-formet mutant Htt samlet “frø”. Konvertering av vill-type Htt av mutant Htt kan bekreftes med biokjemiske eller Biofysiske teknikker som rapporterer protein-protein interaksjoner, for eksempel fluorescens resonans energi overføring (bånd)9,27,41 .
Viktigere, får vi også en rekke genetisk verktøy i Drosophila å identifisere gener og/eller veier som megle prion som spredning av protein aggregat. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen for å avsløre en nøkkelrolle for cellen overflaten scavenger receptor, Draper42,43, overføre mutant Htt aggregater fra neuronal axons til nærliggende phagocytic glia i Drosophila sentrale nervesystemet (CNS)27. Dermed kan den genetiske og bildebehandling-tilnærmingen som vi beskriver her avsløre viktig grunnleggende biologisk informasjon om en sykdom relevante fenomen i enkel-å-bruk men kraftig modell organisme, Drosophila.
Som antall pasienter som lider av nevrodegenerative sykdommer fortsetter å øke, er det et presserende behov for å øke forståelsen av molekylære patogenesen av disse sykdommene slik at bedre behandlinger kan utvikles. Her beskriver vi metodene som tillater for overvåking prion som overføring av patogene protein aggregater mellom ulike celletyper i modellen organismen, Drosophila melanogaster. Vi har nylig brukt denne metodikken å demonstrere prion som overføring av mutant Htt aggregater i vivo …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Kopito, Luo og Pearce laboratorier for mange nyttig diskusjoner under utviklingen av disse metodene. Vi har også takke Brian Temsamrit for kritisk lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Universitetet i realfag og ww Smith veldedige stiftelser.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |