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Neuroscience

Drosophila Melanogaster में Prion-जैसे प्रोटीन समुच्चय के सेल-टू-सेल ट्रांसमिशन का निरीक्षण

Published: March 12, 2018
doi:
10.3791/56906
,
1Department of Biological Sciences,University of the Sciences

Summary

सबूत जमते इस विचार का समर्थन करता है कि रोगजनक प्रोटीन समुच्चय neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े prion की तरह गुणों के साथ कोशिकाओं के बीच फैल । यहां, हम एक विधि का वर्णन करते है जो मॉडल जीव, Drosophila melanogasterमें सेल-टू-सेल प्रसार के दृश्य को prion-जैसे समुच्चय में सक्षम बनाती है ।

Abstract

प्रोटीन एकत्रीकरण सबसे neurodegenerative रोगों की एक केंद्रीय सुविधा है, जिसमें अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington के रोग (एचडी), और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) शामिल हैं । प्रोटीन समुच्चय बारीकी से इन रोगों में neuropathology के साथ जुड़े हुए हैं, हालांकि सटीक तंत्र है जिसके द्वारा ंयायपालिका प्रोटीन एकत्रीकरण बाधित सामान्य सेलुलर homeostasis ज्ञात नहीं है. उभरते हुए डेटा इस परिकल्पना के लिए प्रबल समर्थन प्रदान करते हैं कि AD, पीडी, HD और ALS में रोगजनक समुच्चय prions के लिए कई समानताएं हैं, जो संक्रामक spongiform encephalopathies के लिए जिंमेदार प्रोटीन-केवल संक्रामक एजेंट हैं । एक ही प्रोटीन के मूल रूप से मुड़े संस्करण के रूपांतरण templating द्वारा Prions आत्म दोहराने, एकत्रीकरण phenotype के कारण फैल गया । कैसे prions और prion-विज्ञापन, पीडी, एच. डी., और ALS में प्रोटीन की तरह एक सेल से दूसरे में ले जाता है वर्तमान में गहन जांच का एक क्षेत्र है । यहां, एक Drosophila melanogaster मॉडल है कि prion की तरह की निगरानी परमिट, सेल-के लिए सेल के बारे में संचरण के उत्परिवर्ती huntingtin (Htt) के साथ जुड़े समुच्चय का वर्णन किया गया है । इस मॉडल के कई विभिंन Drosophila ऊतकों में transgene अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए शक्तिशाली उपकरण का लाभ लेता है और एक फ्लोरोसेंट-टैग cytoplasmic प्रोटीन का इस्तेमाल सीधे उत्परिवर्ती Htt समुच्चय की तरह prion हस्तांतरण की रिपोर्ट । महत्वपूर्ण बात, हम यहां वर्णन दृष्टिकोण उपंयास जीन और रास्ते की पहचान है कि vivo मेंविविध कोशिका प्रकार के बीच प्रोटीन समुच्चय के प्रसार मध्यस्थता इस्तेमाल किया जा सकता है । इन अध्ययनों से प्राप्त जानकारी रोगजनक तंत्र की सीमित समझ है कि आबाद neurodegenerative रोगों का विस्तार होगा और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए अवसरों का पता चलता है ।

Introduction

prion परिकल्पना में कहा गया है कि संक्रामक एजेंट संक्रामक spongiform encephalopathies के लिए जिंमेदार (जैसे, Creutzfeldt-Jakob रोग मनुष्यों में, भेड़ में scrapie, हिरण और एल्क में जीर्ण बर्बाद कर रोग, और “पागल गाय रोग” मवेशियों में ) पूरी तरह से प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड से रहित1से बना है । prion रोगों में, सेलुलर prion प्रोटीन (पीआरपीसी) एक गैर देशी, स्थिर गुना (पीआरपीअनुसूचित जाति) है कि अत्यधिक बीटा शीट-अमीर और स्वयं को परिवर्तित करने और स्थिर amyloid में monomeric पीआरपीसी अणुओं की भर्ती द्वारा प्रचार कर सकते है ग्रहण समुच्चय. पीआरपीअनुसूचित जाति समुच्चय इस आत्म नकल तंत्र का उपयोग करने के लिए एक जीव में विभिंन कोशिकाओं के बीच और भी व्यक्तिगत जीवों2के बीच फैल गया ।

प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण भी सबसे neurodegenerative रोगों (अल्जाइमर रोग (विज्ञापन), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington के रोग (एचडी), और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS))3की एक केंद्रीय सुविधा है । इन रोगों में इंट्रा या अतिरिक्त सेलुलर एकत्रित प्रोटीन सभाओं के गठन बारीकी से cytotoxicity4 के साथ जुड़ा हुआ है और समय5के साथ मस्तिष्क के माध्यम से अत्यधिक reproducible और रोग विशेष रास्तों के साथ प्रगति की है, 6. प्रसार के इन नमूनों का सुझाव है कि इन विकारों के साथ जुड़े रोगजनक समुच्चय prion गुणों की तरह है । मजबूत समर्थन अब विज्ञापन, पीडी, एच. डी., और ALS के साथ जुड़े समुच्चय के prion की तरह संचरण के लिए मौजूद है-वे सेल से सेल और टेम्पलेट पहले से अप्रभावित कोशिकाओं में एक ही प्रोटीन के monomeric रूपों के गठन के परिवर्तन का प्रसार7, 8.

prion की जांच की अध्ययन के बहुमत की तारीख करने के लिए प्रोटीन समुच्चय के प्रसार की तरह स्तनधारी सेल संस्कृति मॉडल है, जहां समुच्चय extracellular अंतरिक्ष से भोली कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में हस्तांतरण या किसी अंय सेल से का उपयोग किया गया है कोशिका द्रव्य 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, या माउस दिमाग और निगरानी में कुल युक्त सामग्री इंजेक्शन द्वारा इंजेक्शन स्थल के बाहर कुल उपस्थिति16,17,18,19,20,21,22, 23. हाल ही में, ट्रांसजेनिक जानवरों को प्रदर्शित किया गया है कि intracellular समुच्चय बरकरार दिमाग के भीतर अंय कोशिकाओं में फैले24,25,26,27, 28,29,30. यहां, हम Drosophila melanogasterके बरकरार मस्तिष्क में व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच समग्र हस्तांतरण के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए एक विधि का वर्णन । HD/polyglutamine (polyQ) रोगों के Drosophila मॉडल पहले करीब दो दशक पहले विकसित किए गए थे31,32 और रोगजनक तंत्र है कि इन विकारों आबाद में कई अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है 33. HD एक विरासत neurodegenerative जीन में एक autosomal प्रमुख उत्परिवर्तन की वजह से विकार है कि प्रोटीन huntingtin (Htt) के लिए कोड34। Htt के एन के पास एक polyQ खिंचाव के विस्तार में यह उत्परिवर्तन परिणाम ~ 37 glutamines की एक रोगजनक सीमा से परे टर्मिनस, जिससे प्रोटीन के कारण और कुल35,36गुना । जंगली-प्रकार Htt इस खंड में < 37 glutamines युक्त प्रोटीन उनके देशी गुना प्राप्त है, लेकिन एक Htt कुल "बीज" के साथ प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क पर कुल के लिए प्रेरित किया जा सकता है12,27,37। हम इस homotypic, जंगली प्रकार Htt के nucleated एकत्रीकरण का दोहन prion के लिए एक readout के रूप में हस्तांतरण और उत्परिवर्ती cytoplasmic समुच्चय की Htt प्रविष्टि के रूप में अंय कोशिकाओं में उद्भव ।

तंत्र का निर्धारण जिसके द्वारा prion-की तरह समुच्चय कोशिकाओं के बीच यात्रा असाध्य neurodegenerative रोगों के लिए उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम तेजी से जीवन चक्र का लाभ ले, उपयोग में आसानी, और Drosophila melanogaster के आनुवंशिक पथ के लिए सेल के लिए आणविक तंत्र को परिभाषित करने वाली सेल के उत्परिवर्ती Htt समुच्चय के प्रसार । हमारी प्रायोगिक रणनीति Drosophila, अच्छी तरह से स्थापित Gal4-विशिष्ट ऊपर सक्रिय अनुक्रम (Gal4-यूएएस) प्रणाली38 और हाल ही में विकसित QF-QUAS प्रणाली39में उपलब्ध दो द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों को रोजगार । इन दो स्वतंत्र प्रणालियों युग्मन उत्परिवर्ती और वंय प्रकार Htt transgenes की अभिव्यक्ति प्रतिबंधित एक ही मक्खी के भीतर विशिष्ट कोशिका आबादी के लिए40की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम prion की जांच की तरह उत्परिवर्ती Htt के वितरण की निगरानी द्वारा अपने सामांय रूप से फैलाना, घुलनशील राज्य से cytoplasmic जंगली प्रकार के Htt के पुनर्वितरण, एक पूर्व के साथ शारीरिक संपर्क का प्रत्यक्ष परिणाम, उत्परिवर्ती Htt का गठन कुल “बीज.” जंगली प्रकार Htt के उत्परिवर्ती Htt द्वारा रूपांतरण जैव रासायनिक या भौतिक तकनीक का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है कि रिपोर्ट प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत, जैसे प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट)9,27,41 .

महत्वपूर्ण बात, हम भी एक बड़ी संख्या में आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर सकते है Drosophila में जीन और/या रास्ते की पहचान करने के लिए कि मध्यस्थता prion-जैसे प्रोटीन समुच्चय के प्रसार । हम हाल ही में सेल भूतल मेहतर रिसेप्टर, ड्रेपर42,43के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका अनावरण करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, के लिए ंयूरॉन axons से पास phagocytic glia में Drosophila केंद्रीय में उत्परिवर्ती Htt समुच्चय स्थानांतरित तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)27. इस प्रकार, आनुवंशिक और इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण है कि हम यहां का वर्णन एक रोग के बारे में महत्वपूर्ण बुनियादी जैविक जानकारी प्रकट कर सकते है सरल में प्रासंगिक घटना का उपयोग करें, लेकिन शक्तिशाली मॉडल जीव, Drosophila।

Protocol

1. युग्मन Gal4-और QF-मध्यस्थता Htt Transgene अभिव्यक्ति में Drosophila इकट्ठा और/या ट्रांसजेनिक Drosophila melanogaster लाइनों ऊतक युक्त विशिष्ट Gal4 या QF “ड्राइवरों,” के रूप में अच्छी तरह से जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती Htt transgenes के ब?…

Representative Results

यहां वर्णित तरीके मजबूत एक कोशिका आबादी से Htt प्रोटीन समुच्चय के prion की तरह हस्तांतरण के प्रदर्शन के लिए बरकरार मक्खी सीएनएस में सुदृढ़ डेटा का उत्पादन । कबरा के लिए फैलाना से जंगली प्रकार Htt ?…

Discussion

जैसे-जैसे neurodegenerative रोगों से पीड़ित रोगियों की संख्या में वृद्धि जारी रहती है, वैसे-वैसे इन रोगों की आणविक रोगजनन की समझ को बढ़ाने की तत्काल आवश्यकता है ताकि बेहतर उपचारों का विकास किया जा सके. यहाँ, हम मॉड?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम इन तरीकों के विकास के दौरान कई उपयोगी विचार विमर्श के लिए Kopito, लुओ, और Pearce लैब्स के सदस्यों को धंयवाद । हम भी इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ब्रायन Temsamrit धंयवाद । यह काम विज्ञान विश्वविद्यालय और W.W. स्मिथ चैरिटेबल ट्रस्ट से धन द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 ThermoFisher Scientific AM9625 Dilute to 1X
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-1L
Kimwipes Thomas Scientific 2904F24
20% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered Lampire Biological Laboratories 7332500 Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP Aves Labs GFP-1020 Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed Clontech 632496 Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken ThermoFisher Scientific SA1-7200 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit Life Technologies A11011 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody Life Technologies A21235 Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent Life Technologies S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisher Scientific 12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm) Globe Scientific 1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 Ted Pella 503 use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 Ted Pella 505 use in dominant hand
LAS X image analysis software Leica
Imaris image analysis software Bitplane
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References

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O’Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O’Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer’s disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson’s disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302 (2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington’s disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).

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Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).
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