Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи
Summary
Человеческая кожа выступает в качестве первой линии обороны против внешней среды. Мы представляем метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Эти изолированные кератиноцитов полезны в многочисленных экспериментальных установок и являются весьма подходящую модель для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.
Abstract
Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым сохраняя механический барьер с внешним миром. Кроме того кератиноциты играют важную роль в инициации, техническое обслуживание и регулирование эпидермальный иммунных реакций, будучи частью иммунной системы реагировать антигенной стимулы быстрый, неспецифические способом. Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи и продемонстрировать, что эти клетки реагируют на кальций индуцированной терминала дифференциации, определяемой выражением рост дифференциации маркер involucrin. Кроме того мы показываем, что изолированные кератиноцитов реагировать ИЛ 1β-индуцированной активации внутриклеточных сигнальных путей, как измеряется активации p38 MAPK путь. Взятые вместе, мы описываем метод для изоляции и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Потому что кератиноцитов тип преобладает ячейки в эпидермисе, этот метод является полезным для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.
Introduction
Кожа является большой орган человеческого тела и служит защитным барьером против внешней среды. Кожа состоит из двух основных слоев: дермы и эпидермиса, где эпидермис представляет внешний слой кожи. Наиболее распространённый тип ячейки в эпидермис является кератиноцитов, состоящий из более чем 95% массы1,клетки2. Кератиноциты ведутся на различных стадиях дифференцировки в эпидермисе и организованы в базальной, остистых, гранулированных и ороговевшем слои, которые соответствуют конкретные этапы дифференцировки3. Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым производить нетронутыми барьер с внешним миром.
Кератиноциты, также представляют собой первую линию обороны против патогенов в коже и поэтому играют важную роль в врожденный иммунный ответ4,5. Воздействие кератиноцитов на внешние раздражители приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей и впоследствии, производство целого ряда различных воспалительных медиаторов, включая цитокины, chemokines и противомикробные пептиды. Эти белки кератиноцитов производные участвуют в воспалительной реакции путем набора и активация иммунных клеток, таких как дендритные клетки, нейтрофилов и конкретных T клетки6,7. Таким образом потому что кератиноцитов играют решающую роль в многочисленных биологических процессах, обоснование техника, представленная здесь заключается в том, сформировать в vitro модель для изучения биологии кожи. Первичный кератиноцитов культур, полученных от крайней плоти новорожденных часто используются для изучения кожи биологии8,9. Однако с техникой, описанных здесь, кератиноциты от обоих полов получаются, что приводит к более высокой биологического разнообразия клеток.
Здесь мы представляем подробный протокол для изоляции и генерация первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи, включая техническое обслуживание и замораживания кератиноцитов. Общая цель этого метода заключается в генерации первичных человеческие кератиноциты, который может использоваться в качестве модели для изучения кожный биологии в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем, как легко изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожи и как их культуры в пробирке. Эта модель может иметь широкое применение для исследования биологии эпидермальных клеток и может быть полезным для исследователей, заинтересованных в изу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотела бы поблагодарить за их техническую поддержку Annette Blak Расмуссен и Кристин Мюллер
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
