Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором
Summary
Капиллярного изоэлектрической фокусировки является метод на основе антител, сверхчувствительная, высокая пропускная способность, позволяя подробную характеристику белков и их изоформы биологических пробах крайне мала. Ниже описывается протокол для обнаружения и количественного определения специфических белков и их изоформы автоматизированные и роботизированные образом.
Abstract
Immunoblotting стала обычной техники во многих лабораториях для характеризации белка из биологических образцов. Следующий протокол предоставляет альтернативную стратегию, капиллярные изоэлектрической фокусировки (главный), с много преимуществ по сравнению с обычными immunoblotting. Это на основе антител, автоматизированных, быстрое и количественный метод, в котором полный западных blotting процедуры происходит внутри ультратонких капилляров. Этот метод не требует гель для передачи мембраны, зачистки помарки, или рентгеновские пленки, которые обычно требуются для обычных immunoblotting. Здесь, протеины разделены согласно их заряда (Изоэлектрическая точка; Пи), используя меньше, чем микролитр (400 nL) общего белка lysate. После электрофореза, белки являются иммобилизованных на стенки капилляров, ультрафиолетовый свет лечения, следуют первичный и вторичный (пероксидазы (ПХ) конъюгированных) Антитело инкубации, привязку которого обнаруживается через расширение Хемилюминесценция (ЭСЛ), создавая световой сигнал, который может быть захвачен и Записанная камерой зарядовой (связью ПЗС). Цифровые изображения могут быть проанализированы и количественно (площадь пика) с помощью программного обеспечения. Эта процедура высокая пропускная способность может обрабатывать 96 образцов одновременно; очень чувствительна, с обнаружением белка в диапазоне пикограмм; и производит высоко воспроизводимые результаты благодаря автоматизации. Все эти аспекты являются чрезвычайно ценными, когда количество образцов (например, образцы тканей и биопсии) является ограничивающим фактором. Методика имеет более широкое применение, включая скрининг наркотиков или антител, открытия биомаркеров и диагностических целей.
Introduction
Капиллярные изоэлектрической упором (главный) является автоматизированной, основанный на капиллярной иммуноанализ, устраняющее белков на основе их заряда1,2,3. Это очень воспроизводимость и способный разрешать белков и их post-translationally модифицированных изоформ быстро и количественно. Она представляет альтернативу обычные методы, такие как Западный blotting. В то время как Западный blotting очень хорошо для подтверждающих наличие обильные белков в легкодоступном образцов; изменчивость, время потребления и точный количественный всех присутствующих задач, в частности при рассмотрении образцы биологических тканей. Действительно, изменчивость присущие проблема в Западный blotting, как есть многочисленные шаги, связанные, например, загрузки и запуска гелях SDS-PAGE, перенос белков на мембраны, инкубации с различными реагентами (например., начальное и среднее антитела, ЭСЛ) и развитие на рентгеновской пленки4. В настоящее время западные blotting метод улучшается с осуществлением цифровой записи хемилюминесцентный сигналов (цифровой вестерны). Недавно автоматизированная система западных blotting был разработан, а именно капилляра Западной, которая является более свободные руки и гель свободной системы. Весь assay автоматически после загрузки образца пластины (образцы с всеми необходимыми реагентами) в системе3,4. Инструмент будет выполнять все шаги, такие, как разделение белков, иммобилизации белков на капиллярной стенки, инкубаций антитела, моет между различные шаги и развитием и количественная оценка хемилюминесцентный сигналов. Таким образом главный представленные здесь приведен выше разрешение и чувствительность.
Этот метод является чувствительной, как сигналы могут быть созданы и количественно от пикограмм1белки. Высокая чувствительность с отличную воспроизводимость делает эту технологию очень полезным для анализа клинических образцов. Он может обнаружить, а также отличить пост поступательные изменения (например, различные фосфорилированных белка изоформ) белков. Эта технология успешно используется для рассечения различных сигнальных путей4,5 , в клинических исследованиях, направленных на разработку новой терапии рака3, и он имеет большой потенциал для обнаружения белковых биомаркеров и наркотиков .
Protocol
Representative Results
Discussion
Чувствительность и разрешение белки имеют решающее значение для протеомических исследований биологических образцов. Существует большое значение в состоянии обнаружить белки, которые присутствуют в минуту количествах в клетках. Главный может предложить улучшена чувствительность и ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит Claesson профессор Лена-валлийский, Университет Уппсалы, Швеция для ее поддержки для разработки этого проекта. Кроме того Автор благодарит Росс Смит и Клаессон Лена-валлийский, Уппсальского университета за их критического чтения и предложения для улучшения рукопись.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
