Summary

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

Published: February 22, 2018
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l’attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.

Abstract

Il sistema di espressione genica transitoria è una delle tecnologie più importanti per l’esecuzione di analisi funzionale della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Questo sistema è stato sviluppato per esprimere stranieri geni sotto il controllo del promotore baculovirus in plasmidi di espressione transiente. Inoltre, questo sistema può essere applicato a un’analisi funzionale del baculovirus sé o proteine straniere. Il sistema di espressione genica transitoria più ampiamente e commercialmente disponibile è sviluppato sul promotore del gene immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Tuttavia, è stato osservato un livello basso di espressione di geni estranei in cellule di insetto. Di conseguenza, un sistema di espressione genica transitoria è stato costruito per migliorare l’espressione della proteina. In questo sistema, plasmidi ricombinanti sono stati costruiti per contenere la sequenza di destinazione sotto il controllo del promotore (Dhsp70) 70 di Drosophila calore shock. Questo protocollo presenta l’applicazione di questo calore shock-base pDHsp/V5-His (epitopo V5 con 6 istidina) /Spodoptera frugiperda cell sistema (sf9 cella); Questo sistema è disponibile non solo per l’espressione genica ma anche per valutare l’attività anti-apoptotica di candidato proteine in cellule di insetto. Inoltre, questo sistema può essere sia transfected con un plasmide ricombinante o co-trasfettate due plasmidi ricombinanti potenzialmente funzionalmente antagonistiche in cellule di insetto. Il protocollo dimostra l’efficienza di questo sistema e fornisce un caso pratico di questa tecnica.

Introduction

Due sistemi di espressione della proteina sono stati comunemente utilizzati per la produzione di proteine: sistemi di espressione proteica prokaryote (sistema di espressione del gene diEscherichia coli ) e sistemi di espressione della proteina dell’eucariota. Un sistema di espressione della proteina eucariote popolare è il baculovirus espressione vettoriale sistema (BEVS)1. Baculoviridae in primo luogo sono stati usati come agenti di controllo biologico in tutto il mondo dell’agricoltura e della foresta di parassiti. Negli ultimi decenni, Baculoviridae sono stati sviluppati come strumenti biotecnologici per vettori di espressione di proteine pure. I genomi di Baculoviridae sono costituiti da DNA circolare a doppia elica e avvolti i nucleocapsids2. Ad oggi, più di settantotto baculovirus isolati sono state sequenziate3. Basato sulla cascata temporale di baculovirus espressioni di gene in cellule di insetto ospitante, trascrizione genica poteva essere classificata in quattro cascate temporale, compreso immediati-presto, geni di in ritardo-inizio, fine e molto fine4.

BEVSs sono stati indicati in modo che i promotori di geni molto tardi (cioè, poliedro o p10 promotore) sono stati usati per guidare i geni bersaglio, mentre il baculovirus ricombinanti è stato generato da una ricombinazione omologa. Espressione delle proteine straniere in cellule di insetto di baculovirus ricombinanti è simile a quella delle proteine dei mammiferi a modificazioni post-traduzionali (adatti per la produzione di glicoproteina). Così, il baculovirus è stato ampiamente usato5,6,7. Tuttavia, una limitazione è la presenza di vie di N-glicosilazione differenti in cellule di insetto7.

Di conseguenza, un nuovo sistema di espressione di baculovirus, il sistema di espressione del gene transitoria, è stato sviluppato. Questo sistema esprime geni estranei sotto l’unità di baculovirus immediati-presto promotori (promotore diie-1 ) in cellule di insetto. Utilizzando questo sistema, la proteina bersaglio può essere espresso immediatamente sotto il controllo del promotore ie-1 durante la modifica la via di N-glicosilazione in cellule di insetto, con conseguente migliore oligosaccaridi N-collegati7. Inoltre, geni immediati-presto baculovirus sono trascritti dalla RNA polimerasi II cellula ospite e non richiedono alcun fattore virale per attivazione4. Di conseguenza, proteine straniere possono essere espresso in cellule di insetto in breve tempo. Ad oggi, il transitorio sistema di espressione genica è una delle tecnologie più importanti per l’esecuzione di saggi funzionali della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Il sistema può essere applicato per analizzare la funzione di baculovirus o proteine straniere. Uno dei sistemi di espressione genica transitoria commercialmente disponibile si basa sui promotori di geni immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 e OpIE1 promotori).

Tuttavia, il livello inferiore di espressione di geni estranei in cellule di insetto era ancora un problema quando il sistema di espressione del gene transitoria basata sul promotore di OpIE è stato usato8,9,10. Così, un altro sistema di espressione genica transitoria è stato costruito in base il promotore della drosofila calore shock protein 70 (hsp70) gene di8,9. Il promotore di hsp70 funziona più efficientemente di baculovirus IE promotore quando indotta da shock termico in cellule di insetto10. In questo sistema, sono stati espressi i geni bersaglio sotto l’unità del promotore di Drosophila heat shock 70 (Dhsp70). Geni estranei possono essere facilmente clonati nel plasmide di espressione genica transitoria con i metodi di clonazione PCR-basati. Inoltre, il controllo di temporizzazione per l’espressione genica può essere eseguito tramite induzione di scossa di calore.

In questo rapporto, seguiamo l’approccio ed esprimere tre diversi troncamenti del gene di baculovirus (inibitore dell’apoptosi 3, iap3 da Lymantria xylina MNPV) utilizzando il sistema di espressione basati su scossa transitoria della proteina di calore e applicare ulteriormente queste proteine espresse sulla analisi delle attività anti-apoptotica. Questo sistema può sia esprimere proteine straniere rapidamente o essere applicato alla valutazione delle attività anti-apoptotica della proteina in cellule sf9, pur avendo anche il potenziale per essere applicato ad altre analisi di attività della proteina.

Protocol

1. preparati Coltura delle cellule dell’insetto Preparare 50 mL di mezzo di coltura cellulare. A tale scopo, aggiungere 500 µ l di antibiotici (anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicillina = 100 unità/mL, streptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL di siero bovino fetale inattivati al calore nel mezzo di coltura privo di siero cellulare (senza FBS o antibiotici).Nota: Riscaldare il siero bovino fetale a 65 ° C per 30 min in un bagno di acqua prima dell’uso. Mantenere Spodopt…

Representative Results

L’intera lunghezza e altri due troncamenti (domini BIR e anello) di Ly-IAP3 da LyxyMNPV overexpressed in cellule sf9, basato sul calore shock-base pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda (sf9 cella) sistema di celle. Il pDHsp/V5-His conteneva un promotore di un proteina di scossa calore di Drosophila , che aziona l’espressione genica a valle ad una temperatura di 42 ° C condizione utilizzando fattori trascrizionali cellulari e la traduzione del sistema (<strong class="xfig"…

Discussion

Il concetto di sistema basati su shock cellulare pDHsp/V5-His/sf9 calore era in primo luogo descritto da Clem et nel 19948. Confronto del promotore del gene di baculovirus (IE1) e Drosophila hsp70 ha mostrato che quel hsp70 aveva una maggiore efficienza nella zanzara cellule10. Inoltre, a causa dell’induzione di scossa di calore, la tempistica dell’espressione della proteina potrebbe essere controllata precisamente dopo trattamento di sho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Si ringrazia il Dr. Jian-Horng Leu dell’Istituto di Biologia Marina, National Taiwan Ocean University per la fornitura di 3 costruzioni di plasmide. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant 106-2311-B-197-001 – dal Ministero della scienza e della tecnologia (MOST).

Materials

Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

References

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Cite This Article
Chang, J., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C., Nai, Y. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

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