Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids
Summary
Ein Protokoll wird für die manuelle Synthese von Oligo-Peptoids gefolgt von Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie beschrieben.
Abstract
Peptoids sind Sequenz-gesteuerte Peptid imitiert Oligomere bestehend aus N-alkyliert Glycin Einheiten. Unter vielen möglichen Anwendungen haben Peptoids als eine Art molekulare Informationsspeicherung gedacht. Massenspektrometrie-Analyse ist die Methode der Wahl für die Sequenzierung Peptoids betrachtet worden. Peptoids können über feste Phase Chemie mit einer sich wiederholenden zweistufigen Reaktionszyklus synthetisiert werden. Hier präsentieren wir eine Methode, Oligo-Peptoids manuell zu synthetisieren und die Reihenfolge der Peptoids mit Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) Techniken zu analysieren. Die Probe Peptoid ist ein Nonamer bestehend aus abwechselnd N-(2-Methyloxyethyl) Glycin (Nme) und N-(2-Phenyl) Glycin (Npe) sowie eine N-(2-Aminoethyl) Glycin (Nae) am N-Terminus. Die Sequenz-Formel von der Peptoid ist Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, wo Ac die Acetyl-Gruppe. Die Synthese erfolgt in einem handelsüblichen Festphasen-Reaktionsgefäß. Die Eisbahn Amid Harz dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem Amid-Gruppe am C-Terminus zu erzielen. Das resultierende Peptoid Produkt unterliegt Sequenzanalyse mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung Quelle. Die MS/MS-Messung erzeugt ein Spektrum der Fragment-Ionen aus der Dissoziation des geladenen Peptoid. Der Fragment-Ionen sind je nach den Werten ihrer Masse-Ladungs-Verhältnis (m/Z) sortiert. Die m/Z-Werte der Fragment-Ionen werden gegen die nominalen Massen der theoretisch vorhergesagten Fragment-Ionen, nach dem Schema der Peptoid Fragmentierung verglichen. Die Analyse erzeugt eine Fragmentierung Muster der geladenen Peptoid. Die Fragmentierung Muster ist der Monomer-Reihenfolge der neutralen Peptoid korreliert. In diesem Zusammenhang liest MS-Analyse die Sequenzinformation von der Peptoids.
Introduction
Peptoids sind eine Klasse von Sequenz-gesteuerte Polymere mit Rückgrat Strukturen imitiert die Struktur von Peptiden. Peptoids können aus verschiedenen Aminen synthetisiert werden, ermöglicht Peptoids, höchst abstimmbaren Eigenschaften1,2auszustellen. Peptoids wurden als molekulare Modelle für biophysikalische Forschung, als Therapeutika und konzipiert als Liganden für Proteine3,4,5,6verwendet. Peptoids wurden in einer Vielzahl von biologisch aktiven Verbindungen, wie z. B. Anti-fouling und Antikörper-mimetischen Materialien, antimikrobielle Wirkstoffe und Enzym-Inhibitoren7,8,9entwickelt. Mit einer sehr geordnet und abstimmbaren Natur haben Peptoids auch als eine Art von molekularen Informationen Speicher10gedacht. Die Entdeckung dieser vielfältigen Anwendungen erfordert die Entwicklung von effizienten Analysemethoden zur Charakterisierung der Sequenzablaufs und Struktur des Peptoids. Tandem mass Spectrometry-basierte Techniken haben Versprechen als die Methode der Wahl für die Analyse der Sequenz Eigenschaften der Sequenz-gesteuerte Polymere, einschließlich Peptoids11,12,13gezeigt, 14,15. Jedoch systematische Studien korrelieren die Peptoid Ion Fragmentierung Muster aus mass Spectrometry Studien und die Strukturinformationen von Peptoids sind sehr begrenzt.
Peptoids können leicht mit einem festen Phase Verfahren synthetisiert werden. Die gut entwickelte Methode beinhaltet eine Iteration einer zweistufigen Monomer Zusatz Zyklus16,17. In jedem Zyklus zusätzlich ein Harz-gebundene Amin ist durch eine Halogenessigsäuren Säure (in der Regel Bromoacetic Säure, BMA) acetyliert, und dies ist gefolgt von einer Versetzung Reaktion mit ein primäres Amin. Obwohl automatisierte Synthese Protokolle für Peptoid Synthese routinemäßig angewendet wurden, können Peptoids manuell mit sehr guten Ausbeuten in einem standard Chemie Labor16,18,19, synthetisiert werden 20.
Unser Labor hat hat die Methode der manuellen Peptoid Synthese und vereinfacht das Gerät in die bestehenden Methoden verwendet. Wir haben vorher die Fragmentierung Muster aus einer Reihe von Peptoids mit MS/MS Techniken21,22,23studiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Peptoids charakteristische Fragmentierungen produzieren, wenn sie einer Kollision-induzierte Dissoziation (CID)21,23 unterliegen oder Elektroneneinfang Dissoziation (ECD)22 Experimente. In diesem Artikel zeigen wir wie Oligo-Peptoids in einem standard Chemielabor synthetisiert werden kann, wie mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer CID-Experimente durchführen und wie die spektralen Daten analysieren. Die Peptoid synthetisiert und charakterisiert ist ein Nonamer mit N-terminale Acetylierung und C-terminalen Amidierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Die Struktur der Peptoid ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Nonamer Peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hat unter Verwendung des Protokolls präsentiert synthetisiert. Die Synthese-Apparat beinhaltet eine Spritze wie Polypropylen Festphasen-Reaktionsgefäß und einem mechanischen Schüttler. Die Reaktionsgefäße sind kommerziell verfügbar und kostengünstig. Einem mechanischen Schüttler ist ein gemeinsamen Apparat in Chemie-Laboratorien. Mithilfe einer Spritze wie Reaktionsgefäß werden Lösungen hineingezogen und das Schiff durch manuelles Verschieben d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Herr Michael Connolly und Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) für Technik-Support in Peptoid Synthese danken. Wir anerkennen die Unterstützung durch die National Science Foundation (CHE-1301505). In der Chemie Mass Spectrometry Einrichtung an der University of the Pacific wurden alle Massenspektrometrie Experimente durchgeführt.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
