O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da esterilização de água sanitária e cloro gás na germinação de sementes de uma gama de Arabidopsis genótipos cultivados na mídia estéril. Protocolos de esterilização otimizada foram desenvolvidos para impedir o crescimento de contaminantes microbianos, proporcionando a sobrevivência satisfatória da semente.
Arabidopsis thaliana Mudas (Arabidopsis) muitas vezes precisam de ser cultivadas em meios estéreis. Isto requer esterilização prévia semente para impedir o crescimento de contaminantes microbianos presentes na superfície da semente. Atualmente, as sementes de Arabidopsis são esterilizadas usando duas técnicas diferentes de esterilização em condições que diferem ligeiramente entre laboratórios e não tem sido padronizadas, muitas vezes resultando em esterilização apenas parcialmente eficaz ou na mortalidade excessiva de sementes. A maioria desses métodos não é também facilmente escalável para um grande número de linhas de sementes de diferentes genótipos. Como as tecnologias para a análise do elevado-throughput de Arabidopsis continuam a proliferar, técnicas padronizadas para um grande número de sementes de diferentes genótipos de esterilização estão se tornando essenciais para a realização desses tipos de experimentos. A resposta de um número de linhas de Arabidopsis para duas técnicas diferentes de esterilização foi avaliada com base na taxa de germinação de sementes e o nível de contaminação de sementes com micróbios e outros agentes patogénicos. Os tratamentos incluíam diferentes concentrações de sterilizing agentes e tempos de exposição, combinados para determinar as condições ideais para a esterilização de sementes de Arabidopsis. Protocolos otimizados foram desenvolvidos por dois métodos diferentes de esterilização: lixívia (líquido-fase) e cloro (Cl2) gás (vapor-fase), ambas resultando em taxas de germinação de sementes de alta e mínima contaminação microbiana. A utilidade destes protocolos foi ilustrada através de ensaios de tipo selvagem e mutantes sementes tanto com uma gama de potenciais de germinação. Nossos resultados mostram que as sementes podem ser efetivamente esterilizadas usando qualquer método sem mortalidade excessiva de sementes, embora observaram-se efeitos nocivos da esterilização para as sementes com o mais baixo do que o potencial de germinação ideal. Além disso, uma equação foi desenvolvida para permitir aos investigadores a aplicar as condições de esterilização de gás cloro padronizada para recipientes herméticos de tamanhos diferentes. Os protocolos descritos aqui permitem esterilização de sementes fácil, eficiente e barato para um grande número de linhas de Arabidopsis.
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) é um organismo modelo principal para a pesquisa básica e aplicada na planta biologia1,2,3. Enquanto condições padrão para crescimento de Arabidopsis têm sido bem estabelecida4, o efeito da esterilização de sementes na viabilidade de sementes não foi rigorosamente testado. Meio sólido em chapas ou caixas rotineiramente é usado para facilitar o crescimento de plântulas de Arabidopsis para muitas aplicações experimentais, tais como identificação de mutantes letais homozigotos em uma população segregando, observação de fenótipos atirar e raiz no início estágios, isolamento dos tecidos isentos de organismos patogénicos, coleção de grandes quantidades de tecido de plântulas, seleção de plantas resistentes ou transformants e avaliação de germinação1,2,3,4 . As sementes colhidas de plantas cultivadas em uma estufa ou câmara de crescimento são ocasionalmente contaminados com microorganismos e poeira. Crescimento de plântulas de Arabidopsis em diferentes tipos de mídia estéril requer esterilização prévia semente para remover contaminantes microbianos, tais como fungos e bactérias presentes na superfície da semente. O uso de um regime de esterilização eficaz da semente é fundamental para um equilíbrio de alta germinação mínima contaminação e crescimento vigoroso das plantas.
Os dois métodos mais comuns utilizados para a esterilização de sementes de Arabidopsis baseiam-se na lixívia comercial (líquido-fase) e gás cloro (fase vapor). Vários procedimentos têm sido empregados para ambos esterilização líquido-fase1,4,5,6,7,8,9 , 14,8,10,11,12,13,de15 de sementes de esterilização 10 e vapor-fase de Arabidopsis ,16. No entanto, enquanto esses procedimentos têm sido eficazes na realização de esterilização de sementes de genótipos utilizados, uma análise detalhada do efeito dos tratamentos de esterilização diferentes nas sementes de diferentes genótipos não foi relatada. Portanto, a otimização destes procedimentos de esterilização é necessário definir as condições em que a esterilização eficiente é combinada com taxa de germinação de alta.
A Arabidopsis biológica Resource Center (ABRC) está singularmente posicionada para um) testar a viabilidade de sementes de uma variedade de diferentes genótipos na coleção e b) aproveitar os procedimentos de controle de qualidade aplicados internamente e em resposta ao feedback dos utilizadores sobre a germinação de sementes. Os objetivos das experiências aqui apresentados foram determinar os efeitos de diferentes métodos de esterilização na germinação de sementes de genótipos uma gama de Arabidopsis. Procedimentos de esterilização otimizada que resultem em taxas de germinação de sementes de alta, mantendo a contaminação mínima patógeno são apresentados para a esterilização de gás cloro e o cloro.
Quando crescer sementes de Arabidopsis na mídia estéril, alguma forma de esterilização deve ser aplicada. Tratamentos de esterilização de gás cloro e o cloro resultam em semelhante inibição do crescimento taxa e molde germinação. Nenhum método de esterilização provoca uma redução significativa na taxa de germinação de sementes com alta germinação potencial; no entanto, esterilização da água sanitária é recomendada para linhas com menor potencial de germinação (20-70%), devido a pequena, embora não significantes, melhoria na taxa de germinação em comparação a esterilização por gás (Figura 3A).
Esterilização de sementes de Arabidopsis com concentrações de lixívia de 40-100% para até 10 min fornece percentagens de germinação satisfatória e supressão de molde eficaz. Embora as concentrações de cloro inferior a 40% fornecer esterilização adequada para a maioria dos lotes de sementes, usando uma concentração de 40% ou maiores garantias esterilização eficaz dos lotes de sementes fortemente contaminadas mesmo. É importante para não exceder a 10 min da esterilização ao usar lixívia concentrações igual ou superior a 80% para evitar sementes de alta mortalidade e defeitos no desenvolvimento da plântula.
Tratamento de sementes de Arabidopsis com concentrações de gás cloro de 6,1%, ou 16,5% para resultados de 1h em taxas altas de germinação e eliminação adequada de molde. Concentração de gás cloro baixo (2,1%) pode ser usada com sucesso, aumentando a duração da esterilização para 3h.
Quando poucas linhas precisam ser esterilizados, recomenda-se esterilização líquida em uma solução de água sanitária 50% por 10 min. Para um maior número de linhas, esterilização por gás com uma concentração de gás de 6,1% para 1h é uma opção melhor, já que muitas linhas podem ser esterilizadas rapidamente e facilmente com menos manipulação.
Nossos resultados oferecem condições padronizadas para esterilização tanto grande número de sementes de diferentes genótipos e as sementes com baixa germinação potencial. A única limitação destas técnicas de esterilização é que eles não podem ser aplicados às sementes com taxas de germinação inferior a 20% devido à mortalidade de sementes extensa. Métodos alternativos, tais como sonication17, para aumentar a taxa de germinação, na ausência de esterilização podem ser benéficos nestes casos.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer sua ajuda na preparação de materiais experimentais Gauri Datta. Agradecemos também a Bettina Wittler e James Mann a revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo MCB-1143813 e subsídios NSF DBI-1049341.
0.65 mL Microcentrifuge tubes | GeneMate | C-3260-5 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
1.7 mL Microcentrifuge tube | GeneMate | C-3262-1 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
7 L plastic container | Sistema | 1016265438 | Container in which gas sterilization is performed |
Concentrated HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Chemical used in the process of creating chlorine gas |
Disposable sterile inoculating loop | Fisher Scientific | 22-363-603 | Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates |
Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | Vitamin solution used in the process of making MS media |
Household bleach | Clorox | Regular-Bleach2 | Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation |
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | Chemical used in the process of making MS media |
Micropore surgical tape | 3M | 1530-1 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | Chemical used in the process of making MS media |
Parafilm M | Bemis Company | #PM996 | Parraffin film used to seal sterilization container |
Petri dish 100 X 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
pH indicator strips | Whatman | 2613991 | Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution |
Phytoagar | Fisher Scientific | 50-255-212 | Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Chemical used in the process of making MS media |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | Chemical used in the process of liquid sterilization |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | CS70000 (Col-0) | Arabidopsis wild-type seeds |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_059101C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_072048C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_209076C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081081C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107487C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2 |