Beschrijven we een methode voor de stereotactically-geleide locatie, belichting en ablatie van de auditieve cortex in ratten. De lokalisatie van de ablatie wordt beoordeeld met behulp van een coördinaat kaart postmortale.
De rat auditieve cortex (AC) wordt steeds populairder onder auditieve neurowetenschappen onderzoekers die geïnteresseerd in ervaring-afhankelijkheid plasticiteit, auditieve perceptuele processen en corticale controle van geluid zijn-verwerking in de subcorticale auditieve kernen. Om nieuwe uitdagingen, een procedure nauwkeurig vinden en operatief bloot de auditieve cortex deze onderzoeksinspanning zou versnellen. Stereotactische Neurochirurgie is het routinematig gebruikt in pre-klinisch onderzoek in diermodellen om engraft een naald of elektrode in een vooraf gedefinieerde locatie in de auditieve cortex. In het volgende protocol gebruiken we stereotactische methoden in een nieuwe manier. We identificeren vier coördinaat punten over het oppervlak van de temporal bone van de rat te definiëren van een venster dat, eenmaal geopend, nauwkeurig zowel de primaire (A1 bloot) en secundaire (dorsale en ventrale) cortices van de AC. met behulp van deze methode, wij Voer een chirurgische ablatie van de AC. Nadat een dergelijke manipulatie wordt uitgevoerd, is het noodzakelijk om te beoordelen van de localisatie, grootte en uitbreiding van de laesies gemaakt in de cortex. Zo beschrijven we ook een methode om gemakkelijk vinden de AC ablatie postmortale met behulp van een coördinaat kaart gebouwd door de overdracht van de grenzen van de cytoarchitectural van de AC aan de oppervlakte van de hersenen. De combinatie van de stereotactically-geleide locatie en ablatie van de AC met de lokalisatie van de gewonde gebied in een coördinaat kaart postmortale vergemakkelijkt de validatie van het dier verkregen informatie, en leidt tot een betere analyse en begrip van de gegevens.
De rat is een van de meest gebruikte dierlijke modellen in de auditieve neurowetenschappen. De robuustheid van het gedrag maakt het kundig voor werkzaamheden voor honderden proeven per dag. De gevoeligheid en de spectrale gezichtsscherpte voor hoorzitting1,2, en de anatomische en functionele organisatie van het centrale systeem, vergelijkbaar met andere zoogdieren3, maken de rat een geschikt dierlijk model voor het analyseren van een breed scala aan onderzoeksthema’s in de auditieve neurowetenschappen. De rat auditieve cortex (AC), in het bijzonder, het onderwerp geweest van verschillende anatomische en fysiologische studies die hebben geprobeerd om te begrijpen van de structuur, organisatie en rol in geluidsverwerking3. Tegenwoordig, is de AC populair geworden onder neurowetenschappers kochten ervaring-afhankelijkheid plasticiteit, auditieve perceptie, de synaptische basis van receptieve veld organisatie en de corticale controle van de geluidsverwerking in de subcorticale auditieve kernen4,5,6,7,8,9. Om de uitdagingen die deze nieuwe benaderingen opleveren, zal de procedures die kunnen nauwkeurig zoeken en de AC operatief te geven onderzoeksinspanningen versnellen. Stereotactische technieken maken het gemakkelijk om te lokaliseren specifieke regio’s binnen de hersenen zonder fysiologie testen. Hoewel de hersenen grootte verschilt enigszins tussen dieren, kan de locatie van een bepaald gebied van de hersenen worden bepaald met behulp van stereotactische coördinaten instellen van bezienswaardigheden op de schedel van de hersenen van de rat.
De beperkte ablatie van de AC is de chirurgische verwijdering van de sensorische regio van de cortex meest rechtstreeks verband houden met de hoorzitting. In tegenstelling tot andere methoden gebruikt voor het blokkeren van de activiteit van de AC, zoals koeling of lokale lidocaïne injecties10,11,12, de chirurgische ablatie van de resultaten van de AC in de chronische verlies van functie. AC ablations zijn dus meer geschikt voor het bestuderen van de langetermijneffecten van de corticale vrijheidsstraf, alsmede de latere verschijnselen van plasticiteit van de laesie. De combinatie van stereotactische methoden met chirurgische ablations van de AC is met succes gebruikt voor het bestuderen van de fysiologische, gedragsmatige en moleculaire effecten van corticale controle ontbering13,14,15 ,16,17,18,19. Bijvoorbeeld, is een rat-model met bilaterale AC ablations gebruikt voor het bestuderen van de effecten van corticale ablatie in de auditieve schrikken reflex en auditieve brainstem Reacties (ABR)16. Wij hebben onlangs de effecten dat unilaterale versus bilaterale ablations van de rat AC producten in ABR drempels, amplitudes en latencies op verschillende tijdstippen vergeleken na de verwonding18. Bovendien, is het model van de rat van beperkende AC ablatie ook gebruikt om te bestuderen van het effect van corticofugal traject degeneratie in de inferieure collicus13,14,15 en het binnenoor17 ,19. Nadat een dergelijke manipulatie wordt uitgevoerd in de hersenen, is het noodzakelijk om te beoordelen van de localisatie, grootte en uitbreiding van de laesies gemaakt in de cortex. Hoewel zeer nuttig is, zijn de belangrijkste beperking van tonotopic kaarten op basis van neuronale reacties20,21 het elektrofysiologische technieken die nodig zijn om te zoeken van de auditieve velden in de rat hersenen. Aangezien niet alle laboratoria hebben de benodigde apparatuur en/of expertise om dergelijke opnames te maken, we hebben een coördinaat kaart gebaseerd op de overdracht van de grenzen van de cytoarchitectural van de AC naar een beeld van de hersenen oppervlak18gebouwd. Deze kaart kan zeer nuttig zijn voor de AC geen fysiologie testen vinden.
Dit protocol beschrijft een methode voor de stereotactically geleide locatie, chirurgische belichting en ablatie van de AC bij ratten. Het beschrijft ook hoe onze coördinaat kaart18 te gemakkelijk het lokaliseren van de uitbreiding van de laesie boven de afbeelding van het oppervlak van de ablated hersenen gebruiken.
Een succesvolle hersenoperatie hangt af van twee factoren: levend houden van het dier, tijdens en na de procedure, en nauwkeurig lokaliseren van het interessegebied. Ervoor te zorgen dat de rat is diep verdoofd tijdens de operatie (de terugtrekking reflex testen) en ontvangt voldoende analgetica en niet-ototoxisch antibiotica overleven helpen moeten. Bovendien moet de rat op een verwarming pad worden bewaard totdat het wakker uit de narcose te voorkomen hypothermie. Wordt de gevoeligheid voor infectie zal afnemen, en goede techniek is essentieel: dieren zal halen op hun oplawaai wond, dus ze moeten strak genoeg om te voorkomen dat verwijdering zonder teveel spanning op de wond worden geïmplanteerd.
Nauwkeurig vinden de AC (of enig ander corticale gebied), is het belangrijk om te bepalen van de positie van bregma, lambda en interaural 0 om ze te gebruiken als verwijzingen naar de grenzen van de gerichte regio berekenen. Een fout bij de berekening van de coördinaten zal resulteren in de gedeeltelijke ablatie van AC of de ongewenste aspiratie van andere omliggende gebieden. Zo moet de naald tip alleen raken het bot bij interaural 0, en dan het vertalen van de coördinaten van het antero-posterior en medio-laterale volgens wat beschreven in dit protocol wordt.
In dit manuscript, hebben we ook beschreven hoe operatief bloot en de AC lasertherapie. Er zijn drie belangrijke stappen: het boren proces, de opening en de verwijdering van de hersenvliezen en de ablatie door aspiratie. Boren moet worden uitgevoerd bij een lage snelheid met minimale druk, zoals een snelle boren genereert warmte die in de buurt van subcorticale structuren kan beïnvloeden. Handhaven van een lage snelheid en koeling van het boren gebied met koude steriele zoutoplossing moeten echter schade voorkomen. Bovendien, is minimale druk essentieel om te voorkomen dat een plotselinge onderbreking van de schedel en latere schade aan de onderliggende cortex. De openings- en verwijdering van de hersenvliezen die betrekking hebben op de AC moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat het breken van de bloedvaten. Als bloeden optreedt, de vroege en late prognose is over het algemeen ongunstig en men kan zich afvragen of een dergelijk dier voldoet aan de criteria van de opneming voor een betrouwbare studie. In dit geval raden we euthanasie. Tot slot moet de aspiratie (waarschijnlijk het moeilijkste aspect bij het uitvoeren van een effectieve laesie), worden beperkt tot de grijze stof. Er zijn twee indicatoren die kunnen helpen bij het detecteren van de aanwezigheid van de witte stof: (1) een wijziging in het kleurcontrast, als de witte stof is lichter dan de grijze stof; en (2) de beëindiging van het bloeden uit de perforating slagaders.
Na iedere manipulatie uitgevoerd in de hersenen, is het noodzakelijk om te beoordelen van de localisatie, grootte en uitbreiding van de procedure die is gemaakt in de cortex voor de daaropvolgende analyse en validatie van de gegevens die zijn verkregen van het dier. In dit manuscript, we in detail te beschrijven hoe de ablatie uitgevoerd in de cortex die met behulp van een coördinaat kaart eerder beschreven door onze fractie18lokaliseren. Deze kaart werd gebouwd met behulp van anatomische verwijzingen seriële sectie reconstructies van histologische secties, gecorreleerd met de Paxinos en Watson atlas van de rat hersenen22verkregen. Dienovereenkomstig, de kaart maakt een onderscheid tussen de primaire (A1) en secundaire cortices (dorsale en ventrale) van de AC. Het belangrijkste voordeel van deze coördinaat kaart is dat het mogelijk de snelle lokalisatie van de laesie maakt door een foto genomen van de laterale oppervlak van de hersenen in een matrix Sagittaal hersenen geplaatst boven elkaar plaatsen. Een ander voordeel is dat laboratoria met minder ervaring in anatomie de kaart gebruiken kunnen door het aan te passen aan hun dierlijke modellen. Het is alleen worden de afstanden tussen de bregma, lambda en interaural 0 verwijzingen in de hersenen van een controle, geperfundeerd, en schaal van de kaart omhoog of omlaag dienovereenkomstig. Het Rhinal horizontalis gebruiken als referentie om de afbeelding van de hersenen naar de kaart. De diepte van het baarmoederslijmvlies worden niet in deze coördinaat kaart, bepaald, dus het moet worden bepaald in de hersenen histologische secties.
De combinatie van stereotactische methoden met de chirurgische blootstelling van de AC zijn fundamentele methoden die gemakkelijk kunnen worden aangepast door een onderzoeker die wil richten op de AC in de rat. Dit zou voor een acute experiment of een waarvoor implantatie van permanente apparaten. Bovendien is de chirurgische ablatie van de AC eerder gebruikt als een model voor het bestuderen van de effecten van chronische corticale ontbering in hoorzitting. AC ablations kunnen ook worden gebruikt om het bestuderen van de effecten die eenzijdige AC ablations uitoefenen in andere corticale gebieden, of dienen als een model van een beroerte. Dus zijn de experimentele designs die hier beschreven nuttige methoden die kunnen worden toegepast, afzonderlijk of in combinatie met een brede waaier van experimentele designs.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van het ministerie van economie en concurrentievermogen (MINECO) van de regering van Spanje, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |