Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques
Summary
Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.
Abstract
Structure secondaire de l’acide nucléique non canonique G-quadruplexes (G4) sont impliqués dans divers processus cellulaires, telles que la réplication de l’ADN, transcription, ARN et l’allongement des télomères. Au cours de ces processus, diverses protéines se lient et résoudre les structures G4 pour remplir leur fonction. Comme la fonction G4 dépend souvent de la stabilité de sa structure repliée, il est important d’étudier comment les protéines liant le G4 régulent la stabilité du G4. Ce travail présente une méthode pour manipuler les molécules G4 uniques à l’aide de la pince à épiler magnétique, qui permet des études de la régulation des protéines liant le G4 sur une seule molécule G4 en temps réel. En général, cette méthode consiste à une étendue des applications dans les études des interactions entre protéines/ligands et des règlements sur diverses structures secondaires d’ADN ou d’ARN.
Introduction
Quatre brins ADN ou ARN G4 structures jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques importants1. Beaucoup de protéines est impliquées dans la liaison G4 et de règlement, y compris les protéines de liaison des télomères (télomérase, POT1, TEBPs, RPA, TRF2)1,2, facteurs de transcription (nucléoline, PARP1)3, protéines (hnRNP A1, ARN hnRNP A2)4et réplication de l’ADN hélicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVT, Dna2, Pif1)5associés protéines (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. La liaison aux protéines peut stabiliser ou déstabiliser les structures G4 ; ainsi réguler les fonctions biologiques ultérieures. La stabilité du G4 a été mesurée par thermal fusion à l’aide de rayons ultraviolets (UV) ou de méthodes de dichroïsme circulaire (DC)7. Toutefois, ces conditions ne sont pas physiologiques pertinentes et sont difficiles à appliquer à l’étude des effets de liaison des protéines7.
Le développement rapide des technologies de manipulation de la molécule unique a permis à des études de pliage et dépliage d’une biomolécule, tel qu’un ADN ou une protéine, à un niveau de molécule unique avec une résolution nanométrique en temps réel8. Microscopie à force atomique (AFM), pinces optiques et magnétiques pincettes sont les méthodes de manipulation de la molécule unique plus couramment utilisés. Par rapport à l’AFM et pinces optiques9, pincettes magnétiques permettent des mesures stables de pliage-dépliage de la dynamique d’une seule molécule au cours des jours en utilisant une technique de anti-dérive10,11.
Ici, une plate-forme de manipulation de la molécule unique à l’aide de pincettes magnétiques pour étudier la régulation de la stabilité du G4 par des protéines de liaison est signalé12,13. Cet ouvrage décrit les approches de base, y compris les échantillon et flux de préparation de canal, le programme d’installation de pinces magnétiques et la calibration de la force. Le contrôle de la force et les protocoles anti dérive comme décrit dans étape 3 permettent depuis longtemps des mesures de temps sous les divers contrôles de force, comme la force constante (pince de force) et constante de chargement note (force-ramp) et mesure de force-saut. Le protocole d’étalonnage de force décrit à l’étape 4 permet la calibration de la force de < 1µm sangles courtes sur une large force allant jusqu’à 100 pN, avec une erreur relative au sein de 10 %. Un exemple de règlement de la stabilité de l’ARN hélicase associée AU riche en élément (RHAU) hélicase (alias DHX36, G4R1) qui joue un rôle essentiel dans la résolution de que RNA G4 est utilisé pour démontrer les applications de cette plate-forme13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme décrit ci-dessus, une plate-forme pour l’étude de la stabilité mécanique de l’ADN du G4 et les interactions de protéine à l’utilisation de G4 seule molécule pincettes magnétiques est signalée. Accompagnant la plate-forme, des protocoles très efficaces de trouver l’attache d’ADN G4 et mesure de la dynamique de pliage-dépliage et la stabilité de la structure de G4 avec résolution spéciale nanomètres sont développés. Le blocage du plan focal permet un contrôle anti-dérive très stable, ce …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Meng Pan pour la relecture du manuscrit. Ce travail est soutenu par Singapour Ministère de l’éducation académique recherche fonds de niveau 3 (MOE2012-T3-1-001) à J.Y. ; la Fondation de recherche National par le biais de la mécanobiologie Institut de Singapour à J.Y. ; la Fondation nationale de la recherche, Office, Singapour du premier ministre, en vertu de son Programme de recherche de NRF (NRF recherche prix no FRO-NRFI2016-03 de J.Y. ; le Fonds de la recherche fondamentale pour les universités de la centrale (2017KFYXJJ153) à H. Y.
Materials
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
