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Cancer Research

MicroRNA Based Flüssigbiopsie: Die Erfahrung der Plasma MiRNA Signatur Klassifikator (MSC) für Lung Cancer Screening

Published: October 26, 2017
doi:
10.3791/56326
, , , , , , , ,
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierten Protokolls in die BioMILD screening-Verfahren zur Durchführung des zirkulierenden MicroRNA Signatur Klassifikator Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs.

Abstract

Die Entwicklung eines minimal-invasive Tests wie flüssigen Biopsie für Früherkennung Lunge in der präklinischen Phase ist entscheidend für das Ergebnis dieser tödlichen Krankheit zu verbessern. Micro-RNAs (MiRNAs) sind Gewebe, die bestimmten, kleinen, nicht-kodierende RNAs, die Regulierung der Genexpression, die als extrazelluläre Boten des biologischen Signale handeln kann das Übersprechen zwischen den Tumor und seine umliegenden Mikroumgebung abgeleitet. Sie können somit ideale Kandidaten für die Früherkennung von Lungenkrebs darstellen. In dieser Arbeit wird ein methodischer Workflow für die prospektive Validierung eines zirkulierenden MiRNA-Tests mit custom made mikrofluidischen Karten und quantitative Real-Time PCR in Plasma-Proben von Freiwilligen bei einem Lungenkrebs screening Studie eingeschrieben vorgeschlagen. Seit die Veröffentlichung von Hämolyse-bezogene MiRNAs und mehr allgemeine technische Fragen die Analyse beeinflussen kann, werden die Qualitätskontrolle-Schritte in den Standardarbeitsanweisungen enthalten darüber hinaus auch vorgestellt. Das Protokoll ist reproduzierbare und zuverlässige quantitative Ergebnisse gibt; Allerdings sollte bei Verwendung von großen klinischen Serien pre-analytische und analytische Funktionen vorsichtig bewertet werden.

Introduction

Lungenkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsart weltweit, entfallen etwa 25 % aller Krebs-Diagnosen-1. Trotz des stetigen Rückgangs der Lungenkrebs Sterblichkeit in den letzten 2 Jahrzehnten, vor allem aufgrund der reduzierten Tabakkonsum bleibt Lungenkrebs die häufigste Ursache für Krebstod bei Männern und Frauen. Im Jahr 2017 dürfte es entfallen ca. 25 % und 20 % der gesamten Krebstodesfälle in den Vereinigten Staaten und Europa, bzw.1,2.

Da die Symptome in der Regel nicht in frühen Krankheit auftreten, sind die Mehrzahl der Fälle von Lungenkrebs in späten Stadien diagnostiziert. Dies führt zu eine begrenzte Möglichkeit für therapeutische Intervention und schlechte Wirksamkeit von Behandlungen3. Daher richten sich viele wissenschaftliche Anstrengungen zur Ermittlung eines effektiven Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs.

Eine Vielzahl von screening-Studien zeigt, dass Brust Röntgen kein Wert in der Lunge-Krebs-Screening, während niedrig dosiertes Tomographie (LDCT) ein besseres Werkzeug im Vergleich zum Röntgen berechnete für die Erkennung von frühen Stadium Lungenkrebs Krebs4. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Thatscreening mit dem Einsatz von LDCT Lunge Krebsmortalität unter aktuellen und ehemaligen Kettenraucher5bis zu 20 % reduziert. Diese Daten unterstützen die Verwendung der Lunge-Krebs-Screening in einer Hochrisiko-Population gemäß den Richtlinien von mehreren Fachgesellschaften4,6.

Der Hinweis zu den wichtigsten Anliegen über LDCT Screening ist die hohe Rate der falsch-positiven Ergebnissen und Überdiagnose. Dass insofern die wissenschaftliche Gemeinschaft eine Strategie sucht, um diese Probleme zu überwinden und die Spezifität des LDCT Screening Tests zu erhöhen. Die Entwicklung der nicht-invasiven ergänzende Biomarker könnte hier hilfreich sein. Bis heute gibt es eine umfangreiche Liste von Kandidaten Biomarker untersucht, wie z. B. MiRNAs, zellfreie DNA-Methylierung gen, kleine Proteine und andere7.

Blutbasierte Biomarker, einschließlich Immunantwort Biomarker und zirkulierenden MiRNAs, sind diejenigen, die die erweiterte Validierung Phase8zu erreichen. Die Immunantwort Biomarker basieren auf den Erkenntnissen, die Immunantworten gegen beide intrazellulären und Oberfläche Tumorantigenen in Lunge Krebs Patienten9aufgebaut sind. Zum Beispiel, Ajona Et al. die Rolle der C4d, ein Abbauprodukt des klassischen Ergänzung-Signalwegs in der Diagnose und Prognose von Lungenkrebs Krebs10bewertet. Ansonsten eine handelsübliches Autoantikörper Serum testen Prüfung sieben im Zusammenhang mit Tumor-Antigene validiert in Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und zeigten 36 % der Sensibilität und 91 % Spezifität11wurde. Immunantwort Biomarker sind interessant, aber weitere Validierungsstudien sind für eine mögliche klinische Anwendung erforderlich.

MiRNAs sind endogene kleine nicht-kodierende RNAs mit konservierten Mechanismus und großen funktionellen Bedeutung aller Tier- und Pflanzenarten Königreiche. Die Rolle der MiRNAs ist Protein Übersetzung zu regulieren: sie unterdrücken die Expression von einer großen Anzahl von Ziel Gene12. Es ist gut dokumentiert, dass Veränderungen OfmiRNAs Ausdruck in der Pathogenese der menschlichsten Krebs12,13,14beitragen. Darüber hinaus lösen Tumor und Stromazellen Zellen MiRNAs, stabilisiert durch ihre Einbeziehung in Microvesicles oder durch Assoziation an RNA-bindende Proteine, in Körperflüssigkeiten wie Plasma und Serum15,16, Urin17 , und Speichel18. Zirkulierenden MiRNAs kann somit der Wirtsantwort und die dynamische Wechselwirkung zwischen Tumor und seine Mikroumgebung19reflektieren. Zusammengenommen haben diese Beobachtungen zirkulierenden MiRNAs eine vielversprechende Klasse von Biomarkern für die Erkennung von Krebserkrankungen gemacht.

Zirkulierenden MiRNAs kann mit verschiedenen Methoden erkannt werden: Microarray Plattformen20, quantitative reverse Transkription PCR (RT-qPCR)21und nächsten Generation Sequencing (NGS)14,22. In den letzten Jahren wurden verschiedene Ausdruck Profil Studien basierend auf den oben genannten Technologien entwickelt. Microarray ist eine Hochdurchsatz-Technologie, bis zu Tausenden von MiRNAs in einer einzigen Probe zu analysieren. Es hat jedoch niedriger Dynamikumfang und Spezifität im Vergleich zu RT-qPCR oder NGS. Darüber hinaus Microarray ist eine nicht-quantitative Methode, so dass weitere experimenteller Validierung erforderlich ist. Sequenz-basierte Methoden ermöglicht die Identifizierung von unbekannten MiRNAs und eignen sich vor allem in einem Discovery-Phase. Auf der anderen Seite NGS Methoden sind immer noch teuer und erfordern spezielle Ausrüstung und Experten Bioinformatikern, wodurch ihre Verwendung in großen Validierung Kohorten und in klinischen Umgebungen23. Im Moment ist RT-qPCR die meisten adoptierten Plattform für MiRNA-Erkennung in eine Diagnose/klinischen Kontext24in Umlauf. Gibt es unterschiedliche RT-qPCR-Technologien für MiRNAs Analyse zur Verfügung, aber die Stem-Loop-RT gefolgt von TaqMan PCR ist die am weitesten verbreitete25. Diese Technik ist besonders sensibel und präzise (single Nucleotide Diskriminierung) und hat einen hohen Dynamikbereich; Allerdings ermöglicht es die Erkennung von bekannten MiRNAs nur.

Die MicroRNA-Qualitätskontrolle Studie Mestdagh Et Al. umfassend untersucht die Eigenschaften von einigen im Handel erhältlichen Plattformen für MiRNAs Profilerstellung basiert auf den drei oben genannten Technologien26(MiRQC-Studie). Durch die Analyse von 196 MiRNAs in Geweben und Serumproben, war die Leistung der verschiedenen Plattformen hinsichtlich der Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit, Genauigkeit, Spezifität und Konkordanz der differentielle Expression bewertet. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass Plattformen auf NGS basierend und Microarray Technologien eine höhere Reproduzierbarkeit und Spezifität, aber RT-qPCR-Plattformen waren genauer, empfindlich und hatte eine höhere Erkennungsrate, vor allem für niedrige input RNA-Proben, wie Körper Flüssigkeiten. RT-qPCR scheint somit die am besten geeignete Methode für eine mögliche Anwendung in der klinischen Routinediagnostik zu sein.

Im Jahr 2011 analysiert Sozzi Et Al. das MiRNA-Profil des Plasmaproben von Freiwilligen in einem ersten LDCT Screeningtrial (INT-IEO Testversion)27 eingeschrieben und vier MiRNA-Signaturen von gegenseitigen Verhältnisse unter 24 zirkulierenden MiRNAs komponiert generiert wurden. Diese Signaturen waren in der Lage, die Krankheit freier Individuen von Patienten mit einer Diskriminierung oder tödlichen Lungenkrebs Zeit oder bis zu 2 Jahre vor LDCT Krankheit Erkennung28. In einem weiteren Papier, derselben Gruppe beschrieb zum ersten Mal der MiRNA Signatur Sichter (MSC), durch die Kombination von vier MiRNA-Signaturen, um Patienten in drei Risikostufen zu Schichten: hoher, mittlerer und niedriger. Seine klinische Nutzen wurde in einer großen Retrospektive von mehr als 1.000 eingeschriebene Teilnehmer in der MILDEN Screening-Studie, einer randomisierten Studie zum Vergleich der jährlichen oder zweijährlichen LDCT Arme mit einer Beobachtung Arm29validiert. In der Tat, die Kombination von MSC und LDCT reduziert die LDCT False-Positive-Rate von ungefähr 5 Mal und waren die drei MSC-RisikogruppenGesamtüberleben assoziiert.

Später im Jahr 2013 auf der “Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” (Mailand, es) eine prospektive Screening trial (BioMILD) Umsetzung LDCT mit dem Plasma nach MSC-Test wurde ins Leben gerufen. Freiwillige in der BioMILD Studie eingeschrieben unterziehen LDCT und Blut Entnahme, die sofort bearbeitet wird, um Plasma für MiRNA profiling mit custom made mikrofluidischen Karten zu trennen. Die Kombination der LDCT und MSC Ergebnisse definiert die spezifischen Algorithmus24screening.

In der vorliegenden Arbeit das gesamte methodische Protokoll verwendet in der BioMILD Studie beschrieben wird, ausgehend von Blut Musterkollektion, Plasma Isolation RNA-Extraktion, und die 24 MiRNAs Ausdruck Profilierung mit benutzerdefinierten RT-qPCR mikrofluidischen Karten gemacht. Angesichts der hohen Konsistenz und Reproduzierbarkeit, können diese Verfahren auch für die Entwicklung der MiRNA-basierten flüssigen Biopsien bei anderen Krankheiten verwendet werden.

Protocol

das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Forschung unserer Institution angenommen. 1. Plasma Musterkollektion sammeln 10 mL Vollblut Probe in Vacutainer-Röhrchen mit Spray-beschichtete K 2 EDTA und bei Raumtemperatur lagern. Hinweis: Um die Hämolyse zu minimieren, separate Plasma innerhalb von 2 h. Lagern Sie nicht Vollblut bei niedriger Temperatur (d.h., 4 ° C) zu vermeiden, Thermoschock und Zell-Lyse, die zu einer unspezifischen MiRNA-Version führen. Innerhalb von 1 h, trennen das Plasma durch Zentrifugation zunächst auf 1.258 x g und 4 ° C für 10 min. Überstand Plasma in einer 15 mL-Tube, sorgfältig Vermeidung des Kontakts mit dem lymphozytären Ring übertragen. Zentrifuge das Plasma ein zweites Mal bei 1.258 x g und 4 ° C für 10 min. Aliquoten 1 mL Plasma in 1,5 mL Cryovials, sammeln den Plasma-Anteil an der Unterseite des Rohres zu vermeiden. Speichern die Aliquote bei − 80 ° C, außer für die Bewertung der Hämolyse. Die molekulare Analyse sollte innerhalb von 5 Wochen durchgeführt werden. 2. Bewertung der Hämolyse durch photometrische Messung unmittelbar nach der Plasma Trennung Schritt in eine Küvette für Spektralphotometrie, machen eine 01:10 Verdünnung der Probe mit 1 X PBS-Puffer (z. B., 100 µL des Plasmas in 900 µL 1 X Plasma PBS) und mischen, Homogenisieren it. Hinweis: Die Plasma-Proben sollten nicht eingefroren werden bevor die photometrische Messungen als das Einfrieren-Auftauen der Probe (und vor allem in Lipämische Proben), flockt bilden könnten, die die photometrische Analyse beeinträchtigen. Lesen die Extinktion bei 375 nm, 414 nm, 541 nm und 576 nm mit einem UV-Vis Spektralphotometer mit einem Basislinienkorrektur ließ sich bei 750 nm und eine Länge von 10 mm. führen Sie eine leere Messung mit 1 mL 1 X PBS. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Extinktion bei 414 nm und 375 nm, wenn höher als 1.4, betrachten das Beispiel hämolysiert und wiederholen Sie die Blutentnahme (QC1 in Tabelle 1). 3. Plasma Gesamt RNA Extraktion bereiten Sie eine 1-Thioglycerol/Homogenisierung (OMG) Lösung mit 20 µL 1 Thioglycerol pro mL Homogenisierung Lösung. Da 1-Thioglycerol zähflüssig ist, sorgfältig pipette für eine genaue Messung. Kühlen Sie die OMG-Lösung auf Eis oder bei 2-10 ° C, bevor mit it. Hinweis: Die Arbeitslösung liegt stabil bei 2 bis 10 ° C für 1 Monat. Unterbrechen die lyophilisierten DNase I durch Hinzufügen von 275 µL Nuklease-freie Wasser in die Flasche und vorsichtig mischen (nicht Wirbel zu tun). Als visuelle Hilfe, fügen Sie 5 µL blau färben, die rekonstituierte DNase ich und die Lösung in Einweg-Aliquote in Nuklease-freie Rohre zu verzichten. Speichern der wiederhergestellten DNase I bei-30 ° C bis-10 ° c Ausgehend von 200 µL des Plasmas, 200 µL der gekühlten OMG-Lösung hinzufügen. Vortex 15-30 s um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten. Tritt Schaum, lassen Sie die Probe auf Ice absetzen Fügen Sie 200 µL Lysis Puffer und 25 µL Proteinase K der homogenisierten Probe und Wirbel für 20 s. Inkubation die Proben 15 min in einem Thermomixer bei 37 vorgeheizt ° c Laden eine Patrone für jede Probe auf dem Deck des Instruments und die Plugger in der richtigen Position zu platzieren. Übertragung an die gewünschte Position in der Instrument-Patrone der lysate. Hinzufügen 5 µL DNase ich Lösung in die richtige Position in der Patrone. Fügen Sie 60 µL Nuklease-freies Wasser an der Basis jeder Elution Tube. Wählen Sie die " RSC MiRNA Gewebe " Methode und die automatisierte Reinigung laufen beginnen. Die total RNA-Proben können bei gelagert werden − 80 ° c 4. Taq-basierte RT Taq RT Primer Pool mit MiRNAs von Interesse verwenden, um die RNA in cDNA mit dem Taq MicroRNA Reverse Transcription Kit konvertieren. Bereiten 12 µL RT-Reaktion-Mix auf Eis in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch vorschriftsmäßig Kit, mit 6 µL des benutzerdefinierten Taq RT Primer Pools. Add 3 µL Gesamt RNA für ein Endvolumen von 15 µL und inkubieren Sie Eis für 5 min. Laden der Funktelegrafie-Reaktion auf einem Thermo-Cycler wie folgt konfiguriert: 16 ° C für 30 min, 42 ° C für 30 min, 85 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° c Bemerkung: Die cDNA kann bei-15 bis-20 ° C für mindestens eine Woche. 5. Vorverstärkung Mix 2,5 µL des Produktes RT mit 12,5 µL Taq Master Mix 2 X 3,75 µL Taq Custom Pool und 6,25 µL Nuklease-freies Wasser für ein Gesamtvolumen von 25 µL. Führen die Vorverstärkung Reaktion mit einem Thermo-Cycler entsprechend dem folgenden thermischen Profil: 95 ° C für 10 min, 55 ° C für 2 min, 72 ° C für 2 min, 12 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min. , dann halten Sie bei 99,9 ° C für 10 min und 4 ° c Verdünnen das Produkt durch Zugabe von 175 µL 0.1 X TE, pH 8.0. Bemerkung: Das verdünnte Produkt kann bei-15 bis-20 ° C für mindestens eine Woche. 6. RT-qPCR Reaktion auf Custom Taq Array MicroRNA Karten Gebrauch der 384-Well-MicrofluidicCustom Taq Array MicroRNA Karte Plasmaspiegel von den 24 bestimmte MiRNAs (gesichtet in zweifacher Ausfertigung) auf 8 Proben gleichzeitig zu messen. MiRBase-ID (v21) für 24 MiRNAs sind: hat-MiR-101-3 p, hat-MiR-106a – 5P, hat-MiR-126-3 p, hat-MiR-133a – 3P, hat-MiR-140-3 p, hat-MiR-140-5 p, hat-MiR-142-3 p, hat-MiR-145-5-p, hat-MiR-148b – 3P, hat-MiR – 15 b – 5P, hat-MiR-16-5 p, hat-MiR-17-5 p hat-MiR-197-3 p, hat-MiR – 19 b – 3p, hat-MiR-21-5 p hat-MiR-221-3 p, hat-MiR-28-3 p, hat-MiR – 30 b – 5P, hat-MiR – 30c – 5P, hat-MiR-320a, hat MiR 451a, hat-MiR-486-5 p, hat-MiR-660-5 p und hat-MiR-92a – 3 p. Mix 1.13 µL der verdünnten Probe PreAmp mit 56,25 µL 2 X Taq Universal Master Mix und 55.69 µL Nuklease-freies Wasser in einem Rohr 0,5 mL. Bis zu 8 PCR-Reaktion-Mix auf die Custom Taq Array MicroRNA Karten laden. Zentrifuge bei 311 X g für 2 min. Die eigene Karte mit dem Array Karte Sealer versiegeln. Laufen die Echtzeit-Reaktion mit einem Real-Time PCR System ändern die Radsport-Parameter wie folgt: 94,5 ° C für 10 min, 40 Zyklen von 97 ° C für 30 s und 59,7 ° C für 60 s. 7. Extrapolation von Daten und Kennzahlen Generation Nutzung der Software zu Ct Rohwerte, Einstellung einer automatischen Basislinie, die Hintergrund-Signale und einen festen Schwellenwert von 0,15 für alle Proben und Proben zu entfernen. Entfernen Sie Flecken mit Armen Verstärkung Kurven und/oder schlechte passive Bezugssignale. Export Ct Rohwerte in " XLS " format und verwenden Sie den Ct-Mittelwert der beiden Duplikate zur weiteren Analyse. Korrelat MiRNAs ' Ausdruck Niveaus zu historischen Messungen an Proben der klinischen Studie (Tabelle 2). Wenn mindestens 50 % der Proben auf jeder custom made mikrofluidischen Karte eine Pearson ergeben ' s Korrelation < 97,5, wiederholen Sie die Karte (QC2 in Tabelle 1). Berechnen die − ΔCts zwischen allen MiRNAs, entspricht der log2-Werte der MiRNA Verhältnisse. 8. Bewertung der Hämolyse durch die damit verbundenen MiRNA Signatur generieren die Hämolyse-bezogene MiRNA-Signatur verwenden die folgenden MiRNA-Verhältnisse mit jeweiligen Cut-Offs (log2 Werte) für kurze Lagerung Plasmaproben (1-5 Wochen bei − 80 ° C): MiR-126/451 < − 0,07, 15 b/451 < − 3,67, 221/451 < − 3.18, 30 b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15 b/486-5 p < − 3.86, 221/486-5 p < − 3,17, 30 b/486-5 p < − 1,42, 126/92a < 1,8, 15 b/92a < − 1.8, 221/92a < − 1,04, 30 b/92a < 0,87, 126/16 < − 2,85, 15 b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30 b/16 < − 3,68. Klassifizieren als lipämischen Proben, wo mindestens 50 % der Verhältnisse (8 von 16) jeweiligen Cut-off betragen (QC3 in Tabelle 1). 9. Definition der Ebene des Risikos: hoch, Mittel und niedrig definieren die vier Unterschriften von MiRNA-Verhältnisse die MSC zu komponieren, wie in Abbildung 3: Risiko einer Erkrankung (RD), aggressive Krankheitsrisiko (RAD), Vorhandensein von Krankheit (PD) und aggressive Krankheit (PAD). Für jede Signatur definieren die Verhältnisse, die Überschreitung der jeweiligen Grenzwert für kurze Lagerung Plasmaproben (1-5 Wochen bei − 80 ° C). Die Anzahl der über Verhältnisse als positiv betrachtet werden musste ist 9 von 27 für RD und PD und 14 von 28 für RAD und PAD ( Abbildung 3). Attribut auf jede Probe die jeweiligen MSC Risikostufe wie folgt: geringes Risiko, wenn RD Neg ∩ PD Neg ∩ RAD Neg ∩ PAD Neg; mittlere Risiko wenn RD pos ∪ PD pos ∩ RAD Neg ∩ PAD Neg; oder hohem Risiko wenn RAD pos ∪ PAD pos ( Abbildung 3 B).

Representative Results

Die BioMILD-Studie ist eine prospektive Studie zur Früherkennung von Lungenkrebs mit dem Zweck der Prüfung der Wirksamkeit eines kombinierten LDCT-MSC-Ansatzes als Erstlinien Screening-Tests in einer großen Kohorte von starker Raucher Personen. Eine Klasse von Risiko zugeschrieben wird jeder Freiwillige auf der Grundlage der MiRNA-Test, die Verhältnisse zwischen 24 Plasma zirkulierenden MiRNAs auswertet. Als weitgehend gemeldeten30,31,32ist Hämolyse ein kritischer Punkt für die Analyse von zirkulierenden MiRNA, da falsche Ergebnisse durch eine unspezifische Freisetzung von MiRNAs durch Blutkörperchen erreicht werden konnte. In der vorgeschlagenen methodischen Workflow eine pre-analytische Qualitätskontrolle Schritt (QC1 in Tabelle 1) zur Identifizierung hämolysiert, und somit nicht analysierbar Plasmaproben wurde beschrieben. Abbildung 1 berichtet eine photometrische Analyse der lipämischen (Abb. 1A) und nicht hämolysiert (Abbildung 1B) Plasmaproben mit entsprechenden A414/A375-Werte. Im klinischen Kontext waren das Ergebnis eines molekularen Tests ist entscheidend für Freiwilligenmanagement, diese QC1 ermöglicht die Blutentnahme zu wiederholen und in den meisten Fällen die Wiederherstellung der Probenmaterials. Nach molekularen Verarbeitung sollte die RT-qPCR-Leistung genau ausgewertet werden, um technische Probleme zu identifizieren. Abbildung 2 A zeigt eine RT-qPCR mit geringer Leistung durch eine schlechte passive Referenzsignal. In diesem Fall die Vorverstärkung Produkt zu einer neuen mikrofluidischen Karte Nachladen wird empfohlen. Wenn der RT-qPCR gut, wie in Abbildung 2B abschneidet, die Karte geht zum ersten Post analytische Qualitätskontrolle Schritt um sicherzustellen, dass die MiRNA Ausdruckswerte vergleichbar mit der historischen Messung sind (QC2 in Tabelle 1). Wenn die QC2 Schritt fehlschlägt, ein technisches Problem aufgetreten, während der reversen Transkription oder in der Pre-Amplifikationen, und es ist praktisch die gesamte molekulare Verarbeitung ab reversen Transkription zu wiederholen. Der letzte Schritt der Qualitätskontrolle (QC3 in Tabelle 1) wertet die Hämolyse auch auf molekularer Ebene. Ausdruck Niveaus von 4 Erythrozyten-spezifische MiRNAs (Mir-16, Mir-451, Mir-486-5 p und Mir-92a) waren im Vergleich zu denen von 4 nicht-Hämolyse Verwandte MiRNAs (Mir-126, Mir-15 b, Mir-221 und Mir-30 b), erzeugen die Hämolyse-bezogene MiRNA-Signatur komponiert von der 16 (4 x 4) MiRNA-Verhältnisse. Positive Proben werden als hämolysiert, während negative Proben, die letzte MSC Risikoklassifizierung Ebene gehen, wie Protokoll Abschnitt 9 und Abbildung 3beschrieben, klassifiziert. Abbildung 1: Spektralphotometrische Analyse der frischen Plasmaproben. Spektralfotometrische Profile von (A) 2 hämolysiert und (B) 2 nicht hämolysiert Plasmaproben, Messung der Extinktion Verhältnis zwischen Wellenlängen A414 und A375. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : RT-qPCR Leistung in mikrofluidischen Karten Analyse. Verstärkung und Mehrkomponenten-Grundstücke Armen vergleichen (A) und (B) gute Qualität mikrofluidischen Karten. Alle 24 MiRNAs und einer einzigen mitgebrachten MiRNA sind in jeder Gruppe berichtet. Die Mehrkomponenten Grundstücke illustrieren die passive Referenz-Signale in dieser RT-qPCR-Reaktionen auftreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: MSC-Algorithmus zur Risikostratifizierung. Repräsentative Ergebnisse unter Berücksichtigung 6 Plasma-Proben von Freiwilligen in BioMILD screening Studie eingeschrieben. (A) MiRNA-Verhältnisse Unterschriften von Risiko einer Erkrankung (RD), aggressive Krankheitsrisiko (RAD), Krankheit (PD), Vorhandensein von aggressiven Krankheit (PAD) und entsprechenden Cut-off Werte (log2) für Plasma-Proben aufbewahrt bei-80 ° C bei mindestens 1 Woche und bis zu 5 Wochen. (B) Kombination der vier Unterschriften zu Schichten analysierbar Proben in hoch (H), Mittelstufe (I) und low (L) MSC Risikostufe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Tücken und Herausforderungen des methodischen Workflows
BioMILD die erste prospektive Studie analysieren zirkulierenden MiRNAs als Diagnosewerkzeug ist, wurden Schwellen und Trenngrenzen genutzt für die Datenanalyse aus retrospektiven Serie generiert. Um das Problem der unterschiedlichen Speicherintervall von Plasma-Proben zu überwinden, können die Parameter möglicherweise eine Erhöhung der MSC Leistung erhalten verfeinert werden. Dennoch, bevor MiRNAs Analyse, verschiedene Aspekte des Gesamtprozesses müssen sorgfältig geprüft werden, wie z. B. die Einschlusskriterien, der Probengewinnung und Verarbeitung und der Bioinformatik-Algorithmus angenommen für die Datenanalyse. Die folgenden Abschnitte konzentrieren sich auf die kritischsten Punkte des Workflows in der vorliegenden Arbeit, die großen Probleme der einzelnen Schritte und Strategien zu deren Überwindung dann vorschlagen beschrieben.

Studienpopulation
Aufnahmekriterien für die BioMILD screening-Verfahren sind: 50-75 Jahre alten, schweren aktuelle oder ehemalige (weniger als 10 Jahre) Raucher mit mindestens 30 Pack-Jahren und keine vorherige Erfahrung im Bereich von Krebs innerhalb von 5 Jahren. In dieser Population waren die geschätzten Lunge Krebs Prävalenz und Inzidenz pro Jahr etwa 1 % und 0,7 %, beziehungsweise. Um den MSC-Test wie beschrieben in das vorgeschlagene Protokoll anzuwenden, sollte die Bevölkerung analysiert ähnliche Merkmale pflegen. Insbesondere beinhaltet die QC2 Schritt beschriebenen Vergleich mit den gegebenen historischen Daten aus einer ähnlichen Einwohnerzahl. Während eine Korrelation unter 97,5 technische Probleme hindeuten könnte, auf der anderen Seite sind die meisten Personen mit veränderten zirkulierenden MiRNA Ebenen reflektiert das Risiko für Lungenkrebs tatsächlich unterhalb dieser Schwelle. Das heißt, wenn eine Bevölkerung höheres Risiko an Lungenkrebs zu erkranken QC2 Schritt mit den Parametern hier berichtet zugewiesen wird, kann es akzeptabel Proben ausschließen. Dann sollten neue, richtige Verweisparameter definiert werden, die spezifisch für jede Bevölkerung nach erwarteten Ergebnisse analysiert werden.

Blutentnahme und Hämolyse
Die Sammlung von biologischen Proben ist ein entscheidender Pre-analytischen Schritt, da es Sample-Qualität und Eigenschaften beeinträchtigen kann, so ändern Sie die endgültigen Ergebnisse der Analysen. Bezug auf Blutproben ist es wichtig, frisches Blut zu sammeln und die Probe so schnell wie möglich zu verarbeiten. Proben sollten bei 4 ° C gelagert weder werden nach Blutentnahme, eingefroren, da Einfrieren und Auftauen Passagen Zelle Lysis (Hämolyse) und RNA-Abbau induzieren können. Zur Minimierung von Hämolyse Prozess wird vorgeschlagen, um Plasma innerhalb von 2 h von Blut Sammlung31 zu trennen.

Hämolyse ist vor allem auf den Abbau der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und konsequente Veröffentlichung ihrer Inhalte in der Umgebung. Dies könnte ein Problem für die zirkulierenden MiRNAs testen, da die Freigabe des intrazellulären Inhalts RBCs MicroRNA-Profil im Blut, möglicherweise beeinflussen die Genauigkeit der Plasma-basierte Analyse30dramatisch verändert.

Auch minimale Ebenen der Hämolyse im Plasma-Proben identifizieren können, ist entscheidend für Studien basierend auf zirkulierenden MiRNAs als Biomarker. Hämolyse kann zunächst durch Sichtkontrolle, seit nach der Zentrifugation zweistufig beurteilt werden, die die Farbe des Plasma von gelb bis rot für stark lipämischen Proben reichen kann. Jedoch möglicherweise bloße Sichtprüfung nicht empfindlich genug, im Rahmen der molekularen Biomarker-Forschung.

Eine einfache vor-analytische Methode, lipämischen Plasma-Proben zu identifizieren ist die photometrische Messung bei Wellenlänge (λ) = 414 nm die wichtigsten Oxyhemoglobin Peak Absorption nach entsprechende Anpassung für jede andere Quelle von Störungen. Aus diesem Grund wir normalisiert den 414 nm-Gipfel auf den Wert der Extinktion bei 375 nm, bezeichnend für die Lipid-Inhalt33. Alternativ, oder besser, in Kombination, ein Lipämie-Independenthemolysis Punkten (HS) verwendeten34werden können. Dieses spektralphotometrisch basierende Verfahren erkennen mindestens 6,1 mg/dL freies Hämoglobin. Andernfalls können lipämischen Proben durch den Nachweis von Erythrozyten-spezifische MiRNAs identifiziert werden. Da noch ein sehr geringer Prozentsatz der Hämolyse eine erhebliche Zunahme der Erythrozyten-spezifische MiRNA Level32hervorrufen kann, identifiziert Fortunato Et Al. eine spezifische Hämolyse-bezogene Signatur basierend auf 16 MiRNAs-Verhältnisse, die effizient können Hämolyse in Plasma-Proben-33zu klassifizieren. Die genannten Tests verwendet werden, in Kombination seit der Extinktion Verhältnis 414/375 und/oder der HS in einer Pre-analytische Phase weitere Kosten zu sparen angenommen werden, während der Messung im Zusammenhang mit Hämolyse MiRNAs in einer Post-analytische Phase als eine Qualitätskontrolle verwendet werden kann Schritt.

Zirkulierenden MiRNAs Isolation und RNA Reinheit
Die Extraktion RNA-Verfahren ist eine sehr einflussreiche Schritt für den Erfolg der nachfolgenden Analysen. Ausgehend von einem niedrigen Eingabesample wie Plasma, muss Extraktion so effizient wie möglich, eine genaue Quantifizierung der MiRNAs zu gewährleisten. Plasma zeichnet sich durch hohe Konzentrationen von vielen Proteinen, einschließlich Nukleasen und anderen Komponenten die nachgelagerten enzymatische Reaktionen der RT-qPCR stören können und den Nachweis von zirkulierenden MiRNAs beeinflussen könnten. Mehrere Methoden der Extraktion in diese Arten von Studien benutzt worden, aber in der Regel organische Extraktion, gefolgt von Silica-basierten RNA Anreicherung erlaubt die Entfernung des Plasma-Hemmer besser dann TRIzol allein35. Dennoch wurde in den letzten Jahren manuelle Extraktion durch automatisierte Extraktion ersetzt. Geringe Risiko der Kontamination, die höhere Reproduzierbarkeit und der wirtschaftlichen Verwendung sind die wichtigsten Vorteile von automatisierten Systemen im Vergleich zu manuellen Isolierung Protokolle. Automatisierte Extraktionsmethoden ergab darüber hinaus die höchsten Beträge MiRNA von Blutproben und die höchste Effizienz im Vergleich zu manuellen Protokolle36.

Problem der Normalisierung
Normalisierung der MiRNA-Plasmaspiegel ist nach wie vor ein umstrittenes Thema. In der Tat können Unterschiede in der Sample-Qualität oder Quantität der Identifizierung der wirkliche Veränderungen in MiRNAs Ausdruck Ebenen verursacht durch das Vorhandensein oder die Gefahr von Krankheiten, und so führt zu mehrdeutigen Daten Interpretationen und irreführende Schlussfolgerungen stören. Bisher hat die mangelnde Konsens in verschiedenen Normalisierung Strategien37geführt.

Gesamt-RNS Plasma-Proben entnommen ist in der Regel unterhalb der Schwelle der standard Quantifizierungsmethoden wie UV-Spektrophotometrie oder Fluoreszenz-basierte Spektrophotometrie, so dass RNA Masse Standardisierung38. Folglich sollte ein bestimmtes Volumen, anstatt einen festen Betrag der eluierten RNA als Input für die RT Reaktion39gewählt werden.

Housekeeping Abschriften für die MiRNA-Analyse in Gewebeproben verwendet, eignen sich wie RNU48 und RNU6, nicht für die Normalisierung der extrazellulären MiRNA Messungen, wie sie beide nicht immer im Kreislauf durch RNase-vermittelten Abbau40nachweisbar sind, und sind auch in einer Krankheit-spezifisch37dereguliert. Es ist unklar, ob alle umlaufenden MiRNAs effektiv als Referenz-Steuerelemente verwendet werden könnten. Beispielsweise wird MiR-16 häufig für die Zimmerreinigung, aber d vorgeschlagen.verschiedene Studien haben gezeigt, dass es im Plasma-Proben von Krebs Patienten28,37dereguliert ist. Darüber hinaus sind MiR-16 Ebenen stark durch Hämolyse30betroffen.

Zwar für Hochdurchsatz-Assays messen verschiedene MiRNAs und Normalisierung auf die mittlere Ausdruckswert allgemein anerkannten41, wenn eine begrenzte Anzahl von MiRNAs muss analysiert werden, kann dieser Normalisierung Ansatz angewendet werden. Boeri Et Al. gegründet um die Normalisierung-Problem zu umgehen, zuvor einen Algorithmus basiert auf gegenseitigen Verhältnisse unter 24 MiRNAs28. Ein solcher Ansatz, trotz des Seins sehr nützlich für die Entwicklung von Diagnose-Tool erlaubt nicht leicht unterscheiden effektiv MiRNAs, die möglicherweise eine Rolle in der Entwicklung von Tumoren, und so identifizieren MiRNAs als funktionierende Kalibratoren verändert. Eine weitere effektive Strategie, angenommen von der Fraktion der Bianchi Et Al. , die ein Serum MiR-Test zur Krebs-Früherkennung von Lungenkrebs entwickelt beruhte auf Normalisierung auf das geometrische Mittel aus einer Gruppe von 6 “Zimmermädchen Serum-MiRNAs” Variation weniger zwischen Proben und Klassen von Patienten42.

Merkmale der MiRNA-basierte Flüssigbiopsie und Einsatzmöglichkeiten
Plasma-basierte MSC ist ein molekularer nichtinvasive Test zur Früherkennung von Lungenkrebs bei starken Rauchern untersucht. Der MSC-Test erkennen zwischen- oder risikoreiche Themen vor der Lunge-Krebs-Erkennung durch LDCT, mit hoher Sensibilität (SE, 87 %) und negativen prädiktiven Wert (NPV, 99 %). Insbesondere könnten MSC LDCT Screening implementieren, durch die Reduzierung von falsch-positiven Ergebnissen auf 3,7 % von 19,7 % für LDCT allein29. Der MSC-Test hat auch gezeigt, um eine gute prognostische Leistung haben, wenn man nur Lungenkrebs Krebs-Patienten, und könnte als ein monitoring-Tool verwendet werden, allein oder in Kombination mit anderen klinischen pathologischen Parametern43,44. Der MSC-Test könnte potenziell größere Kohärenz der Lunge Krebs diagnostische Algorithmen, damit Verringerung Screening Wirtschaftlichkeit ermöglichen.

Neben MSC sind andere nicht-invasive Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs berichtet worden. Bianchi Et Al. vorgeschlagen, ein zirkulierende MiR-Test basiert auf einem 34-MiRNA Unterschrift45, dann auf einem 13 MiRNA Signatur42reduziert. Serum-Proben-Fordiscovery und Validierung stammen aus der kontinuierlichen Beobachtung der Rauchen Themen (COSMOS) LDCT screening-Studie, bei der Europäischen Institut für Onkologie (IEO, Mailand, Italien) durchgeführt. Der MiR-Test zeigte 78 % Genauigkeit für die Lunge-Krebs-Erkennung bei Probanden mit hohem Risiko. Zwischen den 13 Serum-MiRNAs und die Komposition der MSC 24 waren nur 5 MiRNAs (MiR-92a, MiR-30 b, MiR – 30 c, MiR-148a und MiR-140-5 p) überlappen. Dies könnte auf die unterschiedliche Art der Proben (Serum vs. Plasma) ab und zu Daten Ausarbeitung fällig. In der Tat wurden für den MiR-Test, die Autoren ausgewählte 6 MiRNAs Verhalten sich als Zimmermädchen im Serum, 3 davon auch unter die MSC MiRNA Verhältnisse (MiR-15 b, MiR-19 b und MiR-197). Trotzdem überprüfen der MSC im Plasma und der MiR-Test in Serumproben mehr tief die Verwendung von MiRNA-basierte Flüssigbiopsie zur Erkennung von Lungenkrebs.

MiRNAs Profilerstellung für die Identifizierung der Lunge-Krebs-Biomarker wurde auch Sputum Proben46durchgeführt. Auswurf kann leicht gesammelt und MiRNA Ausdruck Ebenen scheinen extrem stabil drin sein. Jedoch Lunge-Krebs-Screening-Freiwillige sind älter als 50-55 Jahre und starke Raucher mit Komorbiditäten wie COPD, wodurch Auswurf schwer zu bekommen. In der Tat unter die verschiedenen Körperflüssigkeiten, Plasma ist eine der besten Alternativen zu untersuchen, die potenzielle Rolle von MiRNAs als (aber nicht beschränkt auf) Lunge-Krebs-Biomarker.

Insgesamt kann in der vorliegenden Arbeit beschriebene Verfahren relevant im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten, ohne Einschränkung in der Art der Pathologie untersucht (von Krebs, Nervensystem und Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Diabetes) und der Zweck der klinische Anwendung (ein Biomarker für Diagnose, Prognose oder sogar Ansprechen auf die Behandlung).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca und Chiara Banfi für Umgang mit Freiwilligen in den Prüfungen und für die Amtshilfe; und Claudio Jacomelli und Claudio Citterio für das Datenmanagement. Die Arbeit wurde unterstützt durch die italienische Vereinigung für Krebsforschung [Investigator Grants Nr. 15928 bis 14318 GS und 12162 (spezielles Programm “Innovative Tools for Cancer Risk Assessment und Früherkennung”, 5 x 1000)]; Das italienische Gesundheitsministerium [Grant Nr. RF-2010]; Grant UO1 CA166905 vom National Cancer Institute (USA). MB wurde von einem Fondazione Pezcoller Stipendium unterstützt.

Materials

 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770
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Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).
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