Summary

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Published: December 30, 2017
doi:

Summary

Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.

Abstract

Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son los leucocitos maduros que sirven un papel fisiológico fundamental como fagocitos profesionales capaz de limpiar una gran variedad de partículas. Normalmente, BMDMs están restringidos del sistema nervioso central (SNC), pero tras una lesión, pueden infiltrarse fácilmente. Una vez dentro del tejido lesionado del CNS, BMDMs son el tipo de célula primaria responsable de la separación de desechos celulares derivadas de lesiones, incluyendo grandes cantidades de la ruina del myelin ricos lípidos. Las consecuencias neuropathological de la fagocitosis de desechos BMDM de la infiltración y la mielina dentro del CNS son complejas y no bien entendido. Los protocolos describen, permiten el estudio directo en vitro de BMDMs en el contexto de lesión del CNS. Cubrimos murino BMDM aislamiento y cultura, preparación de desechos de mielina y ensayos para evaluar la fagocitosis de desechos de mielina BMDM. Estas técnicas resultados cuantificables robusto sin necesidad de equipo especializado significativo o materiales, sin embargo pueden personalizarse fácilmente para satisfacer las necesidades de los investigadores.

Introduction

Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son un eslabón importante entre los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos. Como antígeno que presenta las células (APCs), pueden ponerse en contacto con los linfocitos por tanto presentación del antígeno y liberación de citocinas1,2,3. Sin embargo, como los fagocitos profesionales, su función principal es eliminar patógenos, células envejecidas y detritos celulares1,4. Después de una lesión de la médula espinal (SCI), cantidades sustanciales de la ruina del myelin se genera a partir muerte de oligodendrocitos, el tipo de célula responsable de CNS axon myelination5. Nosotros y otros hemos demostrado que la separación de la ruina del myelin es primordialmente responsabilidad de infiltración BMDMs5,6,7. Sin embargo, dentro de la lesión medular engulfment de sitios de la ruina del myelin ha sugerido cambiar estas células normalmente antiinflamatorias hacia un estado pro inflamatorio5,8,9. Como mediadores claves de la neuro-inflamación en la médula espinal lesionada, BMDMs son objetivos clínicos importantes.

Para ayudar a investigar la influencia de BMDMs en la médula espinal lesionada, hemos desarrollado un modelo en vitro para estudiar directamente cómo BMDMs responder a la ruina del myelin. Para mejorar la relevancia biológica, primarias BMDMs murinas y la ruina del myelin recién aisladas se utilizan en estas investigaciones. Como tal, los métodos presentados aquí detallan también el aislamiento y cultivo de primarias BMDMs murinos, así como una técnica de gradiente de sacarosa modificado utilizada para aislar CNS murino deriva mielina escombros10,11,12. La ruina del myelin puede etiquetarse fácilmente con un colorante fluorescente, éster de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), vía que su internalización por BMDMs. CFSE es idóneo para esta aplicación porque es no-citotóxico, y sus permisos de estrecho espectro fluorescente multiplexado con otra fluorescente puntas de prueba de13,14. Tras la fagocitosis, lípidos de desechos de mielina son transportados a través de los lisosomas y empaquetados como lípidos neutros en las gotitas de lípido intracelular5. Para cuantificar esta acumulación de lípidos intracelulares, presentamos un aceite rojo O (ORO) tinción optimizado para análisis de imagen cuantitativo. Este método de tinción simple produce resultados reproducibles robustos y cuantificación15. Estos métodos facilitan el estudio del myelin escombros fagocitosis y lípidos retención con equipo especializado limitada.

Protocol

Los métodos aquí describen en la sección 2 han sido aprobados por el Florida estado Universidad institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) y sigue las pautas establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8º edición . Todos los animales utilizados en este en este protocolo son house en un centro de animales de laboratorio dedicados hasta su uso. Ninguna experimentación en vivo fue realizado antes de su sacrificio. Número de animales se basaron en nec…

Representative Results

Tratamiento de BMDMs con CFSE etiquetado la ruina del myelin debe producir internalización transparente (figura 2). Mientras que un tiempo de 3 horas de interacción es suficiente para BMDMs fagocitar suficiente ruina del myelin añadido para robusta detección aguas abajo, se observa acumulación intracelular con tan poco como 1 hora de la interacción. Sin embargo, algunos residuos de mielina todavía pueden estar presentes en la superficie celular después del lavado. Esto puede ser debi…

Discussion

Los procedimientos aquí descritos utilizan recientemente aisladas la ruina del myelin CNS cruda y primarios macrófagos derivados de médula ósea. Para reducir los gastos de animales, se recomiendan que ambos cerebros y cosechar las células de la médula ósea de cada ratón en el momento del sacrificio. Dos investigadores trabajando juntos al mismo tiempo pueden preparar ambos materiales. Alternativamente, los cerebros pueden almacenarse a-80 ° C en PBS suplementado con antibióticos antes de aislamiento de desechos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean dar las gracias a Glenn Sanger-Hodgson, especialista en medios de comunicación en la Facultad de medicina de FSU por todo su trabajo en producción de vídeo, edición y doblaje de voz.

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01GM100474 y R01GM072611).

Materials

DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
Oil Red O Sigma Aldrich O0625
Equipment
Materials Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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