Summary

Vorbereitung der Keratin-Hydrolysat aus Hühnerfedern und ihre Anwendung in der Kosmetik

Published: November 27, 2017
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Summary

Das Ziel des Protokolls ist Keratin Hydrolysat aus Hühnerfedern durch alkalische enzymatische Hydrolyse vorzubereiten und zu testen, ob hinzufügen von Keratin-Hydrolysat in einem Kosmetik Salbe Basis verbessert die Barrierefunktion der Haut (Steigerung der Flüssigkeitszufuhr und abnehmenden transepidermalen Wasserverlust). Tests werden durchgeführt auf Männer und Frauen freiwillige.

Abstract

Keratin Hydrolysate (KHs) sind bewährte Standardkomponenten in Haarkosmetik. Die feuchtigkeitsspendende Wirkung von KH zu verstehen ist vorteilhaft für Hautpflege Kosmetik. Die Ziele des Protokolls sind: (1) Hühnerfedern in KH durch alkalische enzymatische Hydrolyse zu verarbeiten und reinigen durch Dialyse, und (2) zu testen, ob die Zugabe von KH in eine Salbe-Basis (OB) erhöht die Hydratation der Haut und verbessert die Barrierefunktion der Haut durch abnehmende transepidermalen Wasserverlust (TEWL). Bei alkalischen enzymatische Hydrolyse werden Federn zunächst bei einer höheren Temperatur in einer alkalischen Umgebung und dann unter milden Bedingungen, mit proteolytischen Enzym hydrolysiert inkubiert. Die Lösung von KH wird dialysiert, Vakuum getrocknet und zu feinem Pulver gemahlen. Kosmetische Formulierungen von Öl in Wasser-Emulsion (O/W) mit 2 umfasst, sind 4 und 6 Gew.-% des KH (bezogen auf das Gewicht des OBS) bereit. Prüfung der feuchtigkeitsspendenden Eigenschaften von KH erfolgt auf 10 Männer und 10 Frauen in zeitlichen Intervallen von 1, 2, 3, 4, 24 und 48 h. geprüfte Formulierungen sind an entfettet volar Unterarm Standorten verteilt. Die Hautfeuchte des Stratum corneums (SC) wird durch die Messung der Kapazität der Haut, die gehört zu den weltweit am meisten verwendeten und einfachen Methoden beurteilt. TEWL basiert auf der Messung der Wassermenge pro einen abgegrenzten Gebiet und Zeitraum hinweg von der Haut transportiert. Beide Methoden sind völlig nicht-invasiv. KH sorgt für eine ausgezeichnete Verschlusskrankheit; Je nach der Zugabe von KH in OB bewirkt es eine 30 % Rückgang der TEWL nach Anwendung. KH fungiert auch als ein Feuchthaltemittel wie sie Wasser aus den unteren Schichten der Epidermis an den SC bindet; an die optimale KH-Ergänzung in der OB tritt bis zu 19 % Anstieg der Hydratation bei Männern und 22 % Anstieg der Frauen.

Introduction

Schlachthöfe, die Lebensmittelindustrie und die Gerbereien produzieren jährlich immense Mengen an festen Keratin Nebenprodukte – Wolle, Federn, Borsten, Klauen, Krallen, Hörner und dergleichen. Nach neuesten statistischen Daten ist die totale Lebendgewicht von Hühner, Puten, Enten und andere geschlachtetem Geflügel in den USA 62,5 Milliarden Pfund pro Jahr1; in der EU ist es ca. 28,7 Milliarden Pfund pro Jahr. Wenn man bedenkt, dass Federn bis zu 8,5 % der gesamten Geflügel Gewicht machen, produziert allein die USA jährlich ca. 5,3 Milliarden Pfund Abfall Federn2.

Keratin ist ein Protein, hohe Chemikalienbeständigkeit ausstellen, weil es stark vernetzt mit Disulfidbrücken, die die Verarbeitung erschweren. Erhalt der lösliche Produkte erfordert Spaltung Querverbindungen und ggf. Durchführung von Hydrolyse der Peptidbindungen3. Spaltung der Disulfidbrücken kann durch eine Reaktion des Thiol-Anions nach dem folgenden Muster4,5gehen Sie vor:

Sein + – SbSc– ↔ – Sb + S –einSc

Mit einem sehr hohen pH-Wert Hydrolyse der Disulfidbrücken wird auch angezeigt, nach dem Muster6

– SS + → OH S + – SOH

Unter milden Bedingungen (pH-Wert ca. 8) findet auch Sulfitolysis nach dem folgenden Muster:

– SS – + HSO3 → – SH + SSO –3

Die wirtschaftlichste Art der erniedrigende Keratin ist mikrobiellen Abbau, charakterisiert durch milden Reaktionsbedingungen während der Verarbeitung und hohe Aufschlüsselung Wirkungsgrad (ca. 90 %)7,8. Keratinases werden von einigen Bakterien isoliert vom Boden und Keratin Abfall9produziert. Mikrobielle Keratinases Hydrolyseneigung starr und stark vernetzten Keratin Strukturen10 und die daraus resultierenden KH vorbereitet ist reich an löslichen Proteine, ohne Verlust an essentiellen Aminosäuren, die in ihm erkannt11.

Um ein Protein in kosmetischen Präparaten (z.B., Emulsionen, Lotionen und Gele) zu integrieren, damit die Anforderungen solcher Proteine sind in Wasser löslich, gegebenen Systeme sind transparent, und dieser Re-Aggregation der Peptide wird vermieden, durch hydrophobe Interaktionen. Daher ist eine gängige Praxis, Hydrolysate von Proteinen, wie hydrolysiertes Kollagen, Elastin und Keratin anzuwenden. Beim Hinzufügen von Hydrolysate in kosmetischen Emulsionen werden Maßnahmen ergriffen, um sicherzustellen, dass das Hydrolysat zunächst in Wasser aufgelöst wird. In einigen Fällen ist es wünschenswert, dass das Protein (oder das Hydrolysat) löslich in Alkohol oder anderen organischen Lösungsmitteln12.

KH wird normalerweise in Shampoos, Spülungen, Lotionen und nährende Seren für Haar, ebenso wie Mascara, Nagellack und Augen-Make-up-Agenten vorgestellt. Die KH-Effekte erklärt in der Regel gehören, bilden einen schützenden Film, glätten das Haar oder Nagel-Struktur, erhöhte Plastizität und das Aussehen der behandelten Formation, regulieren die Konsistenz der Produkte, und fördern die Bildung von Schaum13 , 14. es hat auch gezeigt, dass KH reduziert Oberflächenspannung, daher Supplementierung in Kosmetika kann erleichtern, Herabsetzung Emulgator hinzugefügt, um Cremes zu stabilisieren. KH Begrenzung der Auswirkungen der Irritation ausgelöst durch Reinigungsmittel (Tenside), Haut, Augen und Haare, wodurch mögliche Nebenwirkungen von Reinigungsmitteln auf Gewebe (z.B., Austrocknung der Haut, Härte und verminderte Barrierefunktion die Haut). Die hohe Leistungsfähigkeit der Pufferung der Hydrolysate wird auch genutzt, um den pH-Wert von Kosmetika zu stabilisieren; Peptide mit kürzeren Länge haben eine größere Pufferung Wirkung15,16. Obwohl KHs in Haar und Nagel Kosmetik sowie Produkte für die Hautpflege verwendet wird als standard-Komponenten etabliert haben, erscheinen die Studien über die feuchtigkeitsspendende Wirkung von KH nicht in der zeitgenössischen Literatur.

Alkaline-enzymatische Technologie zur Verarbeitung von Keratin Nebenprodukte zu KH entwickelt wurde, und aktive Prüfung ist im Prozess über die Auswirkungen einer Reihe von kosmetischen Zusatzstoffe17,18,19,20 , 21 , 22. der Vorteil der zweistufigen alkalischen enzymatische Hydrolyse mit mikrobiellen Proteasen für Hühnerfedern erreicht eine hohe Effizienz unter milden Reaktionsbedingungen und die Qualität der KH ist sehr hoch im Gegensatz zur Hydrolyse in starke Säuren eingesetzt oder Alkalien. In der ersten Stufe werden Federn bei einer höheren Temperatur in einer alkalischen Umgebung inkubiert, die teilweise stört die Keratin-Struktur und schwillt die Federn; nach Einstellen des pH-Werts, sind die Federn in der zweiten Stufe mit einem proteolytischen Enzym unter milden Bedingungen hydrolysiert. Die dialysierten KH besitzt einen hohen Gehalt an Proteinen.

Im Sinne des hier beschriebenen Verfahrens sind Verarbeitung Geflügelfedern in einem KH durch alkalische enzymatische Hydrolyse und testen die Wirkung der feuchtigkeitsspendenden Eigenschaften von KH auf kosmetische O/W-Emulsion aufgetragen. Die feuchtigkeitsspendenden Eigenschaften werden durch instrumentale nicht-invasive Methoden in Vivountersucht. Die häufigsten Methoden zur Messung der Haut Feuchtigkeit und Barriere Funktion des SC gehören Messung der elektrische Eigenschaften der Haut (Leitwert oder Kapazität). Verschiedene Methoden für die Untersuchung von SC Flüssigkeitszufuhr gehören in der Nähe von Infrarot-multispektralen phantasierende Methode (NIM), magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie, optische Kohärenztomographie oder vorübergehende Thermo-Transfer-23. Barrierefunktion der SC korreliert mit der TEWL SC und es wird gemessen, indem die belüfteten Kammer Methode, unbelüfteten Kammer Methode und offene Kammer Methode24.

Eigenschaften der Modell Formulierungen werden bestimmt mit dem Multi-Sonde-Adapter 5 MPA mit drei Arten von Sonden. Die ersten ein, Corneometer CM 825 Haut Maßnahmen Hydratation durch die Beurteilung von Veränderungen in der elektrischen Leistung von der Oberfläche der Haut; der messende Kondensator zeigt Veränderungen in der Kapazität von der Hautoberfläche in Corneometrische Einheiten. Die Corneometer bietet nur eine relative Bewertung der Haut Feuchtigkeit25. Für TEWL die zweite Sonde Tewameter TM 300, dient zur Messung der Dichtegradient der Wasserverdunstung (in offene Kammer Instrument auf der Grundlage Fick’schens Diffusion rechts) von der Haut indirekt durch die beiden Paare von Sensoren (Temperatur und Relative Luftfeuchtigkeit) zeigt die Menge an Wasser pro einem abgegrenzten Gebiet und Zeitraum (g/m2/h) transportiert werden. Diese Methode kann sogar die geringste Störung der Haut-Barriere-Funktion-26erkennen. Haut-pH ist ein Indikator für die Schranke und Anti-mikrobielle Funktion der SC27. Der Säuregehalt der Haut-Mantel wurde durch eine (dritte) Haut PH 905-Sonde angeschlossen an die MPA 5 Station gemessen. Diese speziell entwickelte Sonde besteht aus abgeflachten Glaselektrode für volle Hautkontakt an ein Voltmeter angeschlossen. Das System misst mögliche Veränderungen aufgrund der Aktivität von Wasserstoff-Kationen, die rund um die sehr dünne Schicht halbfeste Formen an der Spitze der Sonde gemessen. Die Änderungen in der Spannung werden als pH28angezeigt.

Wir präsentieren Ihnen Experimente, die in drei Abschnitte unterteilt: (1) Vorbereitung der KH aus Huhn Federn von zweistufigen alkalischen enzymatische Hydrolyse und dessen Reinigung durch Dialyse (Entfernen von Salzen und niedermolekularen Fraktionen), (2) Vorbereitung von kosmetischen Formulierungen mit 2, 4 und 6 % KH, (3) Prüfung der Eigenschaften von KH durch Messung der Haut Hydratation, TEWL, und pH-Wert der Haut. Getestet wurde auf 10 Frauen mit dem Durchschnittsalter von 27,2 Jahre und 10 Männer mit dem Durchschnittsalter von 26,2 Jahre durchgeführt. Die Methode zur Auswahl der Freiwilligen und der Prüfung selbst wurden im Einklang mit internationalen ethischer Prinzipien der Bio-medizinischen Forschung mit menschlichen Probanden29; alle Personen gaben ihre Einwilligung vor Aufnahme in die Studie. Vor der Prüfung begann, waren die Freiwilligen gebeten, einen Fragebogen über ihren Gesundheitszustand auszufüllen. Die Freiwilligen verpflichtet, vermeiden die Anwendung jedes kosmetische Produkts der Teststellen und umliegenden Regionen während der 24 h vor und während der Testphase; Außerdem durften sie nur kurze Abend wäscht mit fließendem Wasser.

Protocol

Freiwillige wurden unter den Mitarbeitern und Studierenden unserer Universität rekrutiert. Die Methode der Auswahl erfolgte nach “internationale ethische Richtlinien für biomedizinische Forschung Einbeziehung menschlichen Probanden. Rat für internationale Organisationen der medizinischen Wissenschaften, Genf (2002).” KH ist eine häufige kosmetischen Zutat in Haarpflege Produkten (Shampoos, Conditioner, etc.) verwendet und Genehmigung der institutionellen Review Board ist daher nicht erforderlich. <p cla…

Representative Results

Die KH nach den hier vorgestellten Verfahren zubereitet (siehe Abbildung 2) ist gelb in der Farbe, leicht löslich in Wasser mit hohem Proteingehalt (anorganische Feststoffe repräsentieren < 2,0 %); der pH-Wert der Lösung 1,0 % der KH ist 5.3 und erfüllt die Anforderungen für Kosmetik-Grade Hydrolysate. Die Ausbeute an KH von 50 g Rohstoff liegt bei ca. 30 %. Die Molekulargewichtsverteilung von KH wurde durch SDS-PAGE bestimmt und ist in <strong class="xf…

Discussion

Der Vorteil der alkalischen enzymatische Hydrolyse ist, dass sie nach zukünftige Anwendungen von KH geändert werden kann. Zum Beispiel in Haarpflege Kosmetik Anwendungen, bei denen eine leicht bräunliche Farbe eines Produktes kein Hindernis, eine höhere Temperatur in der Hydrolyse einsetzbar führt zu einer höheren Ausbeute von KH. Darüber hinaus die längere Bearbeitungszeit in beiden Phasen des technologischen Verfahrens erheblich beeinträchtigt den Gesamtprozess Effizienz – Ausbeute an KH steigt auf 85 %.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieser Artikel wurde mit Unterstützung des Projekts IGA/FT/2017/007 der Tomas Bata Universität Zlin geschrieben.

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T Novozymes LJP30020 Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L Novozymes PXN40001 Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH Sigma-Aldrich 302510289 Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4 Sigma-Aldrich W290017 Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution Sigma-Aldrich 52455 Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH Penta s.r.o. 40216 Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A) Fagron 608425 Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers IKA-labortechnik Z404020 Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed IKA-labortechnik R 1381 Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures Sigma-Aldrich Z371017-10EA Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9402-100FT Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD DOMO Elektronic DO42325PC Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32 Gemini bv 2770 GS1R Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device Fischer Scientific 6470.0002 Orbital shaking device
KERN 440-47N Kern 440-47N Laboratory balance
KERN 770 Kern 770 -N Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort BMT, MMM Group C 131749 Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO BMT, MMM Group B 050328 Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19 Fritsch 19.1030.00 Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5 Courage & Kazaka Electronic 10225237 MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe Courage & Kazaka Electronic Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe Courage & Kazaka Electronic Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300 Courage & Kazaka Electronic Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020 Heidolph 13-225-007-03-1 Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10 Heidolph Z336688-1EA Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12 Fagor BTT-138 Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter WTW Z313165 High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container RPC Superfos 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name Company Catalog Number Comments
Software
Microsoft Office 2010 Microsoft
C+K software Courage and Khazaka Electronic GmbH MPA 5 station operating software

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Mokrejš, P., Huťťa, M., Pavlačková, J., Egner, P. Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics. J. Vis. Exp. (129), e56254, doi:10.3791/56254 (2017).

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