이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.
마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 파생은 만능 세포는 preimplantation 배아에서 설립 하는 과정입니다. 이 라인 자동 갱신 또는 특정 조건 하에서 분화 하는 능력을 유지 합니다. 이러한 속성으로 인해 mESC은 재생 의학, 질병 모델링 및 조직 공학 연구에 유용한 도구입니다. 이 문서는 피더 세포 백혈병 금지 요인으로 보충 하는 정의 된 매체에에 허용 마우스 긴장에서 blastocysts 경작 여 mESC 라인 높은 파생 효율성 (60-80%)을 얻기 위해 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 파생 매체 (2i 매체)에 두 개의 작은 분자 억제제의 칵테일의 간단한 추가 의해 효율적으로 mESC 라인 비 허용 마우스 긴장에서 파생에 적용할 수 있습니다. 자세한 절차 준비 및 피더 세포, 수집 및 마우스 배아, 그리고 파생의 문화와 mESC 라인의 문화 문화에 제공 됩니다. 이 프로토콜 특수 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 기본적인 포유류 세포 문화 전문 지식 가진 어떤 실험실에서 실시 될 수 있습니다.
배아 줄기 세포 (ESC)는 만능 세포 자체 갱신 또는 특정 조건1에서 차별화 수 유지 preimplantation 배아에서 파생 된. 이러한 속성을 바탕으로, ESC 재생 의학, 질병 모델링 및 조직 공학 연구2에 대 한 유용한 도구가 되고있다.
ESC는 preimplantation 마우스 배아, 발생 하는 낮은 성공3,4마우스 ESC (mESC) 라인에서에서 처음으로 파생 되었다. 년, 파생 효율 낮은 pluripotency 시험관을 유지의 어려움 때문에 남아 있었다. 게다가 피더 세포5, 파생 효율성을 높여주는 존재 식민지 첨부 하 고 karyotypic 안정성6, 프로토콜 이어질 pluripotency 유지 보수 개선의 몇 가지 수정을 강화 합니다. 가장 중요 한 추가 백혈병 금지 요인 (LIF)의 mESC 문화 매체7,8, 129S2 허용 배경9 에서 배아의 사용 그리고 보충 매체와 mESC의 문화 정의 혈 청, 잠재적인 차별화 요인10의 무료. 더 최근에, 강력한 증거는 보이지 mESC 배양 (2i 라고도 함)에 신호 통로의 2 개의 작은 분자 변조기의 칵테일의 pluripotency를 유지 하기 위해 최고의. 칵테일 2i MEK 억제제 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로 억제 함으로써 차별화 신호를 감소, PD0325901 및 GSK3β 억제 물 CHIR99021, 낮은 농도에서 세포 생존을 향상의 조합 구성 Wnt 통로11활성화 하 여
현재 문서에서 우리는 효율적으로 mESC 라인 마우스 blastocysts에서 파생 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 파생 매체 LIF와 혈 청 교체12보충에 피더 세포에 관대 한 긴장에서 배아를 배양 표준 절차를 따릅니다. 이 프로토콜, mESC 라인 효율성 2i 매체에서 그에 해당 된 파생 수 있습니다. 도 불구 하 고, 2i는 문제를 방지 하려면 가능한 pluripotency 유지 관리 또는 작업 비 관대 한 긴장을 할 때 추가할 수 있습니다.
MESC 선 파생 많은 실험실에서 일상적으로 사용 하는 잘 알려진 절차는, 비록 그 효율 항상 pluripotency 유지 보수를 방해할 수 있는 여러 요인으로 인해 예상 대로 높은 것은 아닙니다. 현재 문서에서 우리가 쇼, 단계적으로, 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용 하 여 높은 효율성과 mESC 라인을 설정 하는 방법. 이러한 효율성은 문학에서 보고 된 것과 유사한.
최대 효율을 ?…
The authors have nothing to disclose.
피더 세포 배양, 동물 보호에 대 한 룸 Estabulari 드 라 UAB와 비디오를 기록 하기 위한 Domènec 마틴 그의 기술 지원에 감사 Jonatan 루카스 하 고. 이 작품 정부의 드 Economia y Competitividad AGL2014-52408-R 및 Generalitat 드에 의해 지원 되었습니다 카탈루냐 2014 SGR-524. MVC는 PIF UAB 장학금의 수혜자.
1 mL sryringe | BD | 309628 | |
2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
BSA | Sigma | A3311 | |
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
DMSO | Sigma | 41640 | |
DMEM | BioWest | L0107 | |
FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
HBSS | BioWest | L0611 | |
Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |